燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp蛋白外排活性的影響

周 玄，曹昌娥，楊 嬌，陽美松，邵明園，高洋洋，賴 泳，2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp蛋白外排活性的影響

周 玄1，曹昌娥1，楊 嬌1，陽美松1，邵明園1，高洋洋1，賴 泳1，2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

目的：研究燈盞花素對Caco-2細胞中P-糖蛋白（P-gp）外排活性的影響。方法：采用MTT法檢測燈盞花素對Caco-2細胞存活率的影響，以確定其試驗劑量；通過BCA法測定燈盞花素對Caco-2細胞中總蛋白量的影響，羅丹明123（Rh123）轉運試驗評價燈盞花素作用后時間對P-gp外排活性的影響。結果：燈盞花素濃度<577.95μg/mL時，Caco-2細胞的存活率>90%；燈盞花素能增加Caco-2細胞中P-gp的外排活性，加入Rh123后，Rh123在Caco-2細胞內的累積量先增加再減少；作用60 min后，燈盞花素（120、240μg/mL）對Caco-2細胞內總蛋白量分別上調222.87%，154.23%。結論：燈盞花素能增加P-gp的外排活性，并上調Caco-2細胞中的總蛋白量。

燈盞花素；P-糖蛋白；Caco-2細胞；羅丹明123

燈盞花素是從燈盞花（菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬）中提取的黃酮類活性成分〔1-2〕，主要為燈盞甲素和燈盞乙素（野黃芩苷），絕大多數為燈盞乙素。研究表明，燈盞花素具有擴張血管、增加腦血流量和動脈流量、降低血液黏度和外周阻力、抗血小板聚集等藥理作用〔3-4〕。P-糖蛋白（P-gp）是由人MDR1基因編碼的分子量為170 kDa的外排轉運蛋白，屬于能量依賴型ABC轉運超家族成員，其主要定位于成熟的腸上皮細胞的頂面、肝細胞小管膜、腎和腦血管內皮細胞等組織〔5-6〕。P-gp介導許多外源性化合物的吸收轉運過程，其功能活性的改變對藥物體內藥動學過程具有顯著影響〔7-8〕。體外研究表明，燈盞乙素在Caco-2細胞模型中的跨膜轉運由P-gp介導〔9-10〕，燈盞花素可能會抑制腦組織中P-gp的表達〔11〕；通過鈣黃綠素-AM熒光篩選試驗研究人轉移性惡性黑色素瘤細胞株WM-266-4中燈盞乙素對P-gp活性的影響，結果顯示：燈盞乙素對P-gp表現出弱的抑制作用〔12〕，但尚未明確燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp活性的影響。因此，本研究旨在考察燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp轉運活性的影響，為今后的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Caco-2細胞（中科院昆明動物研究所細胞庫）。DMEM培養基、胎牛血清（FBS，Gibco公司）；雙抗、0.25%胰蛋白酶（美國Millipore公司）；MTT（噻唑藍）、PBS（磷酸緩沖鹽溶液）、羅丹明123（Rh123）均購自Solarbio公司；利福平（索萊寶公司）；DMSO（二甲基亞砜，美國Sigma公司）；燈盞花素（Breviscapin，含94.6%的燈盞乙素，云南植物藥業有限公司，批號：HB201201）；RIPA裂解液（Beyetime，批號：P0013B，主要成分為50 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1%SDS以及sodium orthovan?adate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等）；CO2培養箱（Thermo Scientific）；Purifier Logic+二級生物安全柜（LABCONCO）；Synergy HT多功能酶標儀（美國Bio Tek）；熒光分光光度計（960MC，上海精科）。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 將Caco-2細胞接種于75 cm2的培養瓶中，加入10~15 mL DMEM培養基（含1%雙抗和10%FBS），37℃，5%CO2培養箱中培養，隔天換液，待細胞處于對數期生長（細胞融合率80%~ 90%）時，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細胞毒性實驗（MTT法） 取對數生長期細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔終體積100μL，分為陰性對照組、空白對照組及實驗組，空白對照組不接種細胞。37℃，5%CO2培養箱中培養24 h后，去除每孔培養液，用PBS洗滌2遍。實驗組加入不同濃度的燈盞花素（溶于DMEM中）200μL，陰性對照組和空白對照組加入200μL空白培養基。37℃，5%CO2培養箱中分別培養24、48、72 h后，PBS清洗2遍，每孔加20μL的MTT（5 mg/mL）繼續孵育4 h，終止培養，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min使結晶物充分溶解。空白對照組調零后，用酶標儀測490 nm處的吸光度值（A），按下式計算細胞存活率（cellsurvivalrate），存活率大于90%可認為該濃度的燈盞花素對細胞生長無顯著影響。

1.2.3 燈盞花素作用后時間對Rh123攝取的影響

Caco-2細胞用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，離心（1 000 r/min，5 min）棄上清后，PBS分散成細胞數為1×106個/mL的單細胞懸液，取0.5 mL接種入1.5 mL滅菌的EP管中。空白對照組、陽性對照組和實驗組先分別加入500μL的PBS、利福平溶液（溶于DMEM中，10μmol/L）和燈盞花素溶液（120μg/mL、240μg/mL），37℃，5%CO2培養箱中培養60 min后，置冰上終止反應，4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，再分別加入120μmol/L的Rh123（溶于DMEM中）溶液10μL，37℃、5%CO2培養箱中培養（20、40、60、80、100 min），每到1個時間點，隨機取出1批細胞，置冰上終止作用，4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃離心（2 500 r/min，15 min）棄上清。加入50μL細胞裂解液，充分混勻，置冰上30 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min）。取20μL上清，加入1 980μL PBS混勻后，用熒光分光光度計測定吸收值（激發波長：466 nm，發射波長：535 nm）。

1.2.4 燈盞花素對Caco-2細胞中總蛋白量的影響

取利福平和燈盞花素處理60 min后的Caco-2細胞，加入50μL細胞裂解液，充分混勻，置冰上30 min， 4℃離心（12 000 r/min，5 min），取上清液用BCA法測定蛋白量。

1.2.5 統計學處理 實驗結果采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，組間比較用one-way ANOVA檢驗，各組數據以（xˉ±s）表示。

2 結果

2.1燈盞花素對Caco-2細胞的毒性2 311.80，577.95，144.49，36.12，36.12，9.03和2.28μg/mL的燈盞花素分別與Caco-2細胞共孵育作用24、48及72 h后，除2 311.80μg/mL以外，其他濃度下細胞存活率均大于90%。表明濃度低于577.95μg/mL時，燈盞花素對Caco-2細胞無明顯毒性作用，故選用120、240 μg/mL的燈盞花素進行下一步研究。見表1。

表1 燈盞花素不同濃度下Caco-2細胞的存活率

表1 燈盞花素不同濃度下Caco-2細胞的存活率

藥物燈盞花素濃度/（μg/mL）2 311.80 577.95 144.49 36.12 9.03 2.28細胞存活率/% 24 h 51.54±6.42 91.04±2.24 92.53±3.08 94.96±3.23 91.04±2.67 91.41±1.13 48 h 36.51±0.84 90.85±1.17 94.57±2.11 94.19±2.59 91.86±1.23 91.86±1.63 72 h 48.52±6.21 90.33±0.81 92.83±3.02 94.38±0.98 93.60±2.20 92.55±3.03

2.2燈盞花素作用后時間對Caco-2細胞胞內Rh123累積量的影響利福平、燈盞花素（120、240μg/mL）與Caco-2細胞共孵育60 mim后加入Rh123，與空白對照組相比，20 min時Rh123在胞內累積量分別減少16.64%，38.38%，22.12%（P<0.01）；40 min時Rh123在胞內累積量分別減少58.81%，52.19%，38.51%（P<0.01）；60 min時Rh123在胞內累積量分別減少78.81%，75.19%，70.69%（P<0.01）；80 min時Rh123在胞內累積量分別減少60.17%，61.74%，52.45%（P<0.01）；100 min時Rh123在胞內累積量分別減少20.56%，14.34%，34.94%（P<0.01）；120 min時Rh123在胞內累積量分別減少9.64%（P<0.01），1.16%，21.32%（P<0.01）。以上結果表明，燈盞花素能增加Caco-2細胞中P-gp的外排活性；加入Rh123后，其在Caco-2細胞內的累積量先減少再增加，其中，高濃度（240μg/mL）對Caco-2細胞中P-gp的作用較強。見圖1。

圖1 燈盞花素作用后時間對Caco-2細胞內Rh123累積量的影響（

2.3燈盞花素對Caco-2細胞中總蛋白量的影響

利福平（10μmol/L）、燈盞花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2細胞60 min后，與空白對照組相比，細胞內總蛋白量分別上調123.60%，222.87%，154.23%（P<0.01）。由此可見，燈盞花素對Caco-2細胞中蛋白的表達具有誘導作用。見圖2。

圖2 燈盞花素對Caco-2細胞中總蛋白量的影響

3 討論

燈盞花素臨床上常作為輔助藥物與其他西藥聯合用于心、腦血管疾病的治療，如冠心病、心絞痛、缺血性血管疾病損傷、腦栓塞等〔4〕。據文獻報道，燈盞乙素能抑制人肝微粒體CYP450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4等）及大鼠肝微粒體CYP450酶（CYP2C7、CYP2C11、CYP2D4、CYP3A1等）活性〔9，12〕。燈盞花素可能會抑制腦組織中P-gp的表達〔11〕，而燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp活性的影響尚未明確。故本研究對燈盞花素對Caco-2細胞中P-gp活性的影響進行研究。

本實驗采用120、240μg/mL的燈盞花素分別與Caco-2細胞共孵育，通過測定Caco-2細胞內P-gp底物Rh123的熒光強度來表示其累積量，以反映P-gp轉運活性的改變。結果顯示，共孵育60 min后，Caco-2細胞中P-gp的外排轉運活性增強；加入Rh123后，P-gp的轉運活性隨時間發生改變；其中，高濃度（240μg/mL）對Caco-2細胞中P-gp的作用較強。P-gp抑制劑可通過改變P-gp構象逆轉多藥耐藥，也可通過與其底物競爭P-gp結合位點阻斷藥物的外排〔13〕，從而短時間內即可產生作用。燈盞乙素在Caco-2細胞模型中的跨膜轉運由P-gp介導〔9-10〕。燈盞花素與Caco-2細胞共孵育60 min后，燈盞花素對Caco-2細胞的作用達到平衡，Caco-2細胞中P-gp的外排活性增加，Rh123在Caco-2細胞內的累積量減少，60 min時達到最低。當加入P-gp底物Rh123后，Rh123將與燈盞花素競爭P-gp的結合位點，從而破壞已有平衡，使得Caco-2細胞中P-gp的外排活性逐漸降低，導致Rh123在Caco-2細胞內的累積量又逐漸增加。燈盞花素高濃度（240μg/mL）時的變化趨勢相較于低濃度（120μg/mL）要緩，可能是燈盞花素高濃度時更能保持已有平衡。燈盞花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2細胞60 min后，細胞內總蛋白量分別上調222.87%，154.23%，結合燈盞花素能使Caco-2細胞內Rh123的累積量減少，推測P-gp的量可能增加。但燈盞花素對P-gp蛋白表達量的影響還需進一步研究。

由于P-gp底物比較寬泛（如蒽環類和多肽類抗生素、生物堿、類固醇類激素、局麻藥等），且底物間化學結構及性質差異很大〔14〕，因此，單一底物所得的結果可能并不準確，仍需進一步驗證其他類型的P-gp底物作為探針時，燈盞花素對P-gp活性的影響；同時燈盞花素與其他藥物可能的藥物相互作用也值得深入研究。綜上，燈盞花素短時間內（60 min）就能增強Caco-2細胞中P-gp的外排活性并上調胞內總蛋白量。結果提示，燈盞花素與P-gp底物共同使用時可能產生潛在相互作用，這將為臨床合理用藥提供實驗性參考依據。

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Effectof Breviscapin on the Efflux Activity of P-gp in Caco-2 Cells

Zhou Xuan1,Cao Chang'e1,Yang Jiao1,Yang Meisong1,Shao Mingyuan1,Gao Yangyang1,Lai Yong1,2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the effect of breviscapin on the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.Methods:Cellsurvival rate of Caco-2 cells with differentbreviscapin concentrations were measured by MTT assay.The BCA assay was used to determine the total protein level of Caco-2 cells and the efflux activity of P-gp was determined by Rhodamine-123 assay after the incubation with breviscapin.Results:The cell survival rate of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration ofbreviscapin was less than 577.95μg/mL.The efflux activity of P-gp was increased by breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）in Caco-2 cells.The intracellular accumulation of rhodamine-123 was increased and then decreased after the addition of rhodamine-123.After the incubation for 60 min with breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）,total protein level in Caco-2 cells was up-regulated 222.87%,154.23%respectively.Conclusion:Breviscapin can up-regulate totalprotein leveland increase the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.

Breviscapin;P-gp;Caco-2 cell;Rhodamine-123

R285

A

2096-2266（2017）04-0020-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.006

（責任編輯 李 楊）

國家自然科學基金資助項目（81241139；81360511）；云南省教育廳科學研究基金資助項目（2013J118）

2016-08-19

2016-11-08

周玄，碩士研究生，主要從事體內藥物分析研究.

*通信作者：賴泳，教授.