頭穴叢刺聯合康復療法對局灶性腦梗死大鼠神經功能缺損及缺血側皮層VEGF蛋白表達的影響

唐強,阮野,葉濤,朱路文,吳孝軍,李宏玉,田源

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頭穴叢刺聯合康復療法對局灶性腦梗死大鼠神經功能缺損及缺血側皮層VEGF蛋白表達的影響

唐強1,阮野2,葉濤2,朱路文1,吳孝軍2,李宏玉2,田源2

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150001)

目的 觀察針康法對局灶性腦梗死大鼠神經功能缺損情況及缺血側大腦皮層血管內皮生長因子蛋白表達的影響,探討針康法促進大鼠受損功能恢復的作用機制。方法 選取健康雄性SD大鼠90只,隨機分為模型組、針刺組、康復組、針康組、假手術組5組,每組又分為3 d、7 d、14 d 3個亞組,每個亞組6只。采用改良的Zea-Longa線栓法制備右側大腦中動脈永久性梗死(MCAO)模型。針刺組大鼠行模擬頭穴叢刺法治療;康復組行跑臺訓練;針康組行頭穴叢刺結合跑臺訓練;模型組及假手術組不予以任何治療。采用改良的神經功能缺損評分(mNSS)評定大鼠神經功能缺損情況,并采用Western blot法測定缺血側大腦皮層VEGF蛋白表達量。結果 假手術組大鼠未見神經功能缺損。與模型組相比,針刺組、康復組及針康組治療3 d后mNSSs比較,差異均無統計學意義(＞0.05);治療7 d、14 d后,針刺組、康復組及針康組mNSSs評分比較,差異均有統計學意義(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組的mNSS評分均低于針刺組和康復組(＜0.05);針刺組和康復組mNSS評分比較,差異無統計學意義(＞0.05)。治療3 d后,各治療組大鼠VEGF蛋白表達量與模型組大鼠比較差異均無統計學意義 (＞0.05),7 d、14 d各治療組大鼠VEGF蛋白表達量較模型組大鼠明顯增多(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組VEGF表達量與針刺組、康復組比較,差異具有統計學意義(＜0.05);康復組與針刺組大鼠各時間點VEGF表達量比較,差異無統計學意義(＞0.05)。結論 頭穴叢刺法與康復訓練均能夠改善局灶性腦梗死大鼠受損的神經功能,并能夠提高大鼠缺血大腦皮層中VEGF蛋白表達量,且針康法聯合治療能夠取得更好的效果;其機制可能與VEGF的高表達能夠更好地促進腦缺血區域血管的重塑與再生相關。

針刺療法;穴,百會;叢刺;康復訓練;改良神經功能缺損評分;血管內皮生長因子;腦梗死

腦卒中歸屬于中醫學“中風病”的范疇,又分為缺血性卒中和出血性卒中兩大類,其中缺血性卒中又稱腦梗死,是臨床中神經系統方面的常見病、高發病,已經成為現今人類三大致死疾病之一,并具有極高的致殘率,存活者多遺留有不同程度的運動功能障礙、語言障礙、智力障礙等神經功能缺損情況,給家庭和社會造成了沉重的負擔。頭穴叢刺療法自上世紀70年代創立以來發展飛速,至今經過多方研究證實已得到國內外的普遍認可,是臨床治療腦卒中的常用針刺方法;而現代康復治療技術,以解剖學、運動學、生物力學等理論為基礎,涵蓋物理治療、作業治療、言語治療等多方面訓練方法,能夠最大限度地恢復患者喪失的運動及神經功能,為患者更好地回歸家庭與社會起到了至關重要的作用。近些年,將頭穴叢刺與康復訓練相結合已成為臨床針對腦梗死疾病的重要治療手段。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是作用于血管內皮細胞的生長因子,其作用在于促進血管內皮增生、增強血管通透性和加速新生血管形成3個方面,對缺血損傷后的大腦起著至關重要的保護作用[1-3]。

本實驗采用改良的Zea-Longa線栓法制備永久性大腦中動脈梗死(MCAO)模型,應用改良神經功能缺損評分(modified Neurological Severity Score, mNSS)評定大鼠各時間點神經功能恢復情況,并采用Western blot技術測定各組大鼠VEGF蛋白的表達,探討針康法促進腦梗死大鼠損傷功能恢復的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年清潔級雄性SD大鼠90只,體重(250±30)g,由黑龍江中醫藥大學動物飼養中心提供[合格證號SYXK(黑)2010007],隨機分為模型組、針刺組、康復組、針康組、假手術組5組,每組又分為3 d、7 d、14 d 3個亞組,每個亞組6只。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑(BZM、PMSF和PEP)、吐溫-20、過硫酸銨、b-巰基乙醇(2-ME)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚丙烯酰胺、TEMED、Tris、Glycine、PVDF、雜交膜、預染蛋白Marker (10-180kDa)、VEGF抗體、ACTIN抗體、二抗。

1.2.2 主要儀器

PB-10型PH計(Sartorius公司),PAC1000型電泳儀(Bio-RAD公司),AL204電子天平(Mettler-Toledo公司),轉膜槽(Bio-RAD公司),超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司),超低溫高速離心機(江蘇南京溫諾儀器設備有限公司),微量移液器(上海佳安分析儀器廠),華佗牌一次性針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司)。

1.3 動物模型制備

除假手術組外,其余各組均參照Zea-Longa線栓法[4]進行改良,經頸總動脈進線制備右側MCAO模型。大鼠蘇醒后,以出現右側Horner征,提尾測試軀干左側卷曲,爬行時向患側轉圈為造模成功并可入組標準。假手術組同等條件抓取下造模方法同上,但僅分離暴露頸動脈,不對大腦中動脈進行梗死。

1.4 處理方法

針刺組大鼠于造模成功24 h后,參照大鼠穴位圖譜[5],取大鼠百會穴及左右旁開2 mm,共3點,75%乙醇消毒后采用0.25 mm×13 mm毫針向鼻尖方向平刺入帽狀腱膜下5 mm,以模擬頭穴叢刺針法,每次捻轉2 min,速度200轉左右/min,留針30 min。每日1次。

康復組行跑臺訓練,每次30 min,坡度0°,速度15 m/min。每日1次。

針康組行頭穴叢刺后將大鼠帶針置于跑臺上進行訓練,針刺及訓練方法同針刺組和康復組。每日1次。

模型組與假手術組不予以任何治療。

1.5 改良神經功能缺損評分(neurological severi- ty scores, NSS)

參考經典NSS神經功能缺損評分法[6]進行改進,更改為14分評分表。

1.6 樣本取材處理

各組大鼠在各時間點嚴格按照無菌要求,深度麻醉后快速取腦,分離右側大腦皮層,置于液氮中保存。

1.7 Western blot測定VEGF蛋白的表達水平

從液氮中取出腦組織放入預冷研缽充分短時研磨,加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織,充分混勻后將懸液放入EP管中,使用前加蛋白酶抑制劑。將懸液放在冰上冰浴20 min,確保裂解充分,離心20 min后收集上清。采用BCA蛋白定量試劑盒定量檢測各標本總蛋白。

將測定好濃度的細胞裂解液與4×sample buffer混勻,置于100℃沸水中5 min,低速離心3～5 s,室溫冷卻,將蛋白marker和樣品依次加到凝膠的上樣孔中,空余的上樣孔用1×sample buffer補齊。進行SDS- PAGE電泳。預先將PVDF膜在甲醇中浸泡5～10 min,使之激活,采用濕法將凝膠轉移至電轉夾中,使膠位于陰極,PVDF膜位于陽極,緊密固定之后置于電專槽中,注入transfer buffer,在冰上以200 mA轉膜2 h。將轉有蛋白的PVDF膜放入雜交袋中,再加入3%的BSA- TBST封閉液,置于翻轉儀上平緩翻轉,封閉2 h。將PVDF膜與抗體稀釋液置于雜交袋中孵育過夜。用TBST對PVDF膜進行洗滌。將辣根過氧化物酶標記的二抗用3%的BSA-TBST封閉液稀釋,與PVDF膜置于雜交袋中,孵育1.5 h。用TBST對PVDF膜進行洗滌。按照ECL增強發光液試劑盒的說明書配制曝光液,向PVDF膜上滴加顯色曝光。結果采用Quantity One圖像分析軟件進行定量分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用-檢驗。以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠各時間點VEGF蛋白陽性表達量比較

治療3 d后,各治療組大鼠VEGF蛋白表達量與模型組大鼠比較未見顯著差異(＞0.05),7 d、14 d各治療組大鼠VEGF蛋白表達量較模型組大鼠明顯增多(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組VEGF表達量與針刺組、康復組比較,差異具有統計學意義(＜0.05);康復組與針刺組大鼠VEGF表達量比較,差異無統計學意義(＞0.05)。詳見圖1、2,表1。

假手術組 模型組 康復組 針刺組 針康組 VEGF 3 dACTIN VEGF 7 dACTIN VEGF 14 dACTIN

圖2 各組大鼠VEGF表達灰度值分析

表1 各時間點各組大鼠VEGF表達灰度值分析

注 :與假手術組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與針刺組比較3)＜0.05;與康復組比較4)＜0.05

2.2 各組大鼠各時間點mNSS比較

假手術組無神經功能缺損發生。治療3 d后,各治療組mNSSs與模型組大鼠比較,差異均無統計學意義(＞0.05);治療7 d、14 d后各治療組mNSSs與模型組大鼠比較,差異均具有統計學意義(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組mNSS均顯著低于康復組與針刺組(＜0.05);康復組與針刺組大鼠mNSS比較,差異無統計學意義(＞0.05)。詳見表2。

表2 各時間點各組大鼠mNSS比較 (±s,分)

表2 各時間點各組大鼠mNSS比較 (±s,分)

組別n3 d7 d14 d 假手術組6000 模型組68.85±1.181)7.41±0.951)5.23±1.121) 針刺組68.71±1.211)6.37±1.051)2)4.15±1.071)2) 康復組68.69±1.081)6.35±1.071)2)4.11±1.011)2) 針康組68.65±1.171)5.13±1.271)2)3)4)2.27±1.051)2)3)4)

注 :與假手術組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與針刺組比較3)＜0.05;與康復組比較4)＜0.05

3 討論

神經行為學評定是現代動物實驗針對神經功能改變情況的直接記錄手段,是觀察腦梗死大鼠神經功能缺損與恢復水平的一項重要指標[7-8]。既往研究中,Seo HG等[9]曾對腦梗死大鼠采用抓握實驗和前肢放置實驗進行評定,以觀察大鼠平衡協調能力的改善。Du Y等[10]也曾在電針治療腦梗死大鼠的實驗中,采用神經行為學評分評定大鼠神經功能的損傷情況,并得出結論,其治療機制可能與電針有加速缺血區血管再生的作用, 利用頭穴叢刺及康復訓練對腦梗死大鼠進行干預,亦是對神經功能損傷進行的研究。與模型組相比,治療 7 d、14 d后,針刺組、康復組及針康組mNSSs評分均降低(＜0.05),表明頭穴叢刺療法、康復訓練均可改善腦梗死大鼠受損的神經功能。針康法作為二者的聯合治療手段,該組大鼠治療7 d、14 d后mNSS降低,較單一治療組更明顯(＜0.05),表明針康法能夠更好地改善缺血造成的神經功能損傷。治療7 d、14 d后康復組mNSS與針刺組比較,無顯著性差異(＞0.05),表明對于神經功能損傷的改善兩者并無明顯差異。

既往國內外已有大量文獻報道過VEGF與缺血性腦損傷的密切相關性[11-15]。它直接作用于血管內皮細胞,是一種特異性很強的多功能因子,在缺血性腦損傷發生過程中能夠發揮調控血管內皮細胞的增殖分化、新生血管形成和血管的通透性的作用[16]。由于中樞神經元對缺氧刺激非常敏感,當腦梗死發生后,缺氧環境就成為一種特異的激活信號,誘導VEGF應激性表達增高,發揮相應作用,提高腦組織缺血區的灌注及供氧,盡可能控制腦損傷發展[17]。對局灶性腦梗死動物的VEGF變化亦早有大量研究,觀察到梗死后7 d VEGF高表達,同時血管增生活躍,證實了VEGF作為血管修復因子與腦缺血環境的相關性及其重要的腦血管保護意義[18-20]。而臨床對腦梗死患者血清VEGF變化規律的研究也證實,患者缺血發作后血清中VEGF呈動態增高表達,初期腦血流量減少時VEGF表達迅速上調,7 d內上升趨勢明顯,而隨著腦血供改善其表達也逐漸減少, 7～14 d放緩,14 d后開始有回落趨勢,從而證實了VEGF在缺血發生后的腦組織血流灌注中發揮了重要作用[21-26]。在本實驗中,治療7 d、14 d后局灶性腦梗死模型組大鼠VEGF表達水平較假手術組大鼠明顯增加(＜0.05),提示VEGF通過生成血管提高了缺血側腦組織的血液灌注,與既往研究相符。經頭穴叢刺療法、康復訓練治療7 d、14 d后,VEGF表達較模型組增多(＜0.05),康復組與電針組比較,差異無顯著性(＞0.05),與mNSS結果相一致,表明頭穴叢刺與康復訓練對缺血性腦損傷均具有一定的腦血管修復作用,且神經功能缺損的改善與VEGF表達增多相關。治療7 d、14 d后,各組大鼠中針康組VEGF表達量最多 (＜0.05),提示頭穴叢刺聯合康復訓練能夠令缺血側血管得到更好的修復, mNSS也表明該組大鼠受損神經功能恢復得最好,強調了這一結論。

本研究表明,針康法對局灶性腦梗死大鼠受損神經功能的改善明顯優于頭穴叢刺或康復訓練的單一治療,這一結論與其能夠更好地促進缺血側腦組織VEGF的表達密切相關,同時也強調了這種相關性是其治療缺血性卒中的重要機制之一。本研究為探討針康法促進腦梗死發作后神經功能缺損改善提供了新的研究方向,證實了聯合治療優勢的可靠性,為其更加廣泛地應用于臨床提供了新的理論支持。但同時,本研究尚存在不足之處,治療介入的最優時間、檢測時間點的密度等都有待于進一步研究。

[1] Wu L, Jiang Y, Zhu J,. Orosomucoid1: Involved in vascular endothelial growth factor-induced blood-brain barrier leakage after ischemic stroke in mouse[J]., 2014,109(10):88-98.

[2] Ma Y, Qu Y, Fei Z. Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia[J]., 2011,89(7):969- 978.

[3] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H,. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - part 1: in physiology and pathophysiology[J]., 2011,62(5):444-455.

[4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversi- ble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]., 1989,20(1):84-91.

[5] 華興邦,李辭蓉,周浩良,等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,5(1):1-5.

[6] Chen J, Li Y, Wang L,. Therapeutic benefit of intra- venous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]., 2001,32 (4):1005 -1011.

[7] 王輝,王蓉,何婭,陳松盛.大鼠腦梗死模型神經行為學評價的可靠性探討[J].陜西醫學雜志,2015,44(6): 649-651.

[8] 鐘藝華,唐顯軍,李光勤,等.不同穴組電針對局灶性腦梗死大鼠神經行為學及Neurocan表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2013,19(5):444-447.

[9] Seo HG, Kim DY, Park HW,. Early motor balance and coordination training increased synaptophysin in subcortical regions of the ischemic rat brain[J]., 2010,25(11):1638-1645.

[10] Du Y, Shi L, Li J,. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area were detected after electroacupuncture treatment to rats with ischemic stroke[J]., 2011,33 (1):101-107.

[11] 王軍,尚鳳偉,朱登納,等.銀杏內酯B對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織Caspase-3及VEGF mRNA表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2013,48(2):175-178.

[12] 孫桂蓮,楊志亮.新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時腦細胞VEGF的表達與凋亡的關系[J].中國醫科大學學報,2011,40(6):524-527.

[13] 方邦江,周爽,陳浩,等.復元醒腦湯對糖尿病合并缺血性腦損傷大鼠VEGF蛋白的影響[J].上海中醫藥雜志,2010,44(5):12-15.

[14] 王衛東,王琳,鄧麗影,等.內源性VEGF表達對缺血性腦損傷后成年大鼠海馬齒狀回神經發生影響的實驗研究[J].中風與神經疾病雜志,2009,26(4):388-391.

[15] 張珊珊,鄭湘榕,楊于嘉,等.腺病毒介導VEGF165基因轉移對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用[J].中國當代兒科雜志,2008,10(6):737-742.

[16] 趙麗靜,劉亢丁.血管內皮細胞生長因子治療缺血性腦卒中的新思路[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2011, 5(7):2022-2025.

[17] Sun Y, Jin K, Xie L,. VEGF-induced neuropro- tection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J]., 2003,111(12):1843-1851.

[18] Wang YQ, Guo X, Qiu MH,. VEGF over-expression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion[J]., 2007,85(1):73-82.

[19] Ma Y, Zechariah A, Qu Y,. Effects of vascular endothelial growth factor in ischemic stroke[J]., 2012,90(10):1873-1882.

[20] Fujiki M, Abe E, Nagai Y, et al. Electroconvulsive seizure-induced VEGF is correlated with neuroprotective effects against cerebral infarction: Involvement of the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway[J]. Exp Neurol, 2010, 225(2):377-383

[21] Stowe AM, Plautz EJ, Eisner-Janowicz I,. VEGF protein associates to neurons in remote regions following cortical infarct[J]., 2007,27 (1):76-85.

[22] 金崗生,馮炯,陳衍,等.急性腦梗死患者VEGF濃度變化與NIHSS評分的關系[J].中國現代醫生,2016,54 (19):17-20.

[23] 王翠蘭,石秋艷,孫原,等.急性腦梗死患者血清VEGF與bFGF水平的動態變化[J].中風與神經疾病雜志,2014,31(4):292-294.

[24] 史福平,王惠凌,邸衛英,等.急性腦梗死患者MMP-9和VEGF的動態變化及其意義[J].臨床醫學,2014,34 (1):3-5.

[25] 陳生,胡志濤.VEGF與急性腦梗死的關系[J].安徽醫藥,2011,15(5):606-607.

[26] 何建明,李玉蓉,韋英秀,等.急性腦梗死患者治療前后VEGF水平動態變化的研究[J].世界中西醫結合雜志,2010,5(9):762-764.

Effect of Acupuncture plus Rehabilitation on Neurologic Deficit and VEGF Protein Expression in Cortex on the Infarction Side in Rats with Focal Cerebral Infarction

1,2,2,-1,-2,-2,2.

1.,150040,; 2.,150001,

Objective To observe the effect of acupuncture plus rehabilitation on neurologic deficit and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in cortex on the infarction side in rats with focal cerebral infarction, and to explore the action mechanism of acupuncture plus rehabilitation in promoting the recovery of impaired function in rats. Method Ninety healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a model group, an acupuncture group, a rehabilitation group, an acupuncture-rehabilitation group, and a sham operation group, and the five groups were further divided into three subgroups, i.e. 3 d, 7 d, and 14 d subgroups, 6 rats in each subgroup. The modified Zea-Longa method was adopted to prepare the model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) on the right side. Rats in the acupuncture group received simulant scalp-points cluster needling; the rehabilitation group was intervened by treadmill exercise; the acupuncture-rehabilitation group was intervened by scalp-points cluster needling plus treadmill exercise; the model group and sham operation group didn’t receive any interventions. The modified Neurological Severity Score (mNSS) was adopted to evaluate the rat’s neurologic deficit, and Western blotting was used to detect the expression of VEGF protein in cortex on the infarction side. Result Neurologic deficit wasn’t found in rats in the sham operation group. After 3-day treatment, the mNSSs in the acupuncture group, rehabilitation group, and acupuncture-rehabilitation group were insignificantly different from the score in the model group (＞0.05), while the differences were statistically significant respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the mNSS of the acupuncture-rehabilitation group was significantly lower than that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there was no significant difference in comparing the mNSS between the acupuncture group and rehabilitation group (＞0.05). After 3-day treatment, the expression of VEGF protein in each treatment group was insignificantly different from that in the model group (＞0.05), while the expression of VEGF protein in each treatment group was significantly higher than that in the model group respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the expression of VEGF in the acupuncture-rehabilitation group was significantly different from that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there were no significant differences in comparing the expression of VEGF at each time point between the rehabilitation group and acupuncture group (＞0.05). Conclusion Scalp-points cluster needling and rehabilitation both can improve the neurologic function in rat models of focal cerebral infarction, and enhance the expression of VEGF protein in infarction cortex, and the integration of acupuncture and rehabilitation can achieve a better result; the action mechanism is possibly related to the high expression of VEGF which can better promote the reconstruction and regeneration of the vessels in cerebral infarction area.

Acupuncture therapy; Point, baihui (GV20); Cluster needling; Rehabilitation; Modified Neurological Severity Score; Vascular endothelial growth factor; Cerebral infarction

1005-0957(2017)05-0602-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0602

國家自然科學基金項目(81273818,81473762);黑龍江中醫藥大學領軍人才計劃(2012RCL02)

唐強(1963—),男,教授,博士,Email:tangqiang1963@163.com

2016-10-28