電針對脊髓損傷后小鼠神經功能重塑的機制研究

衛哲

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電針對脊髓損傷后小鼠神經功能重塑的機制研究

衛哲1,2

(1.麗水學院醫學與健康學院,麗水 323000;2.汕頭大學醫學院神經科學中心,汕頭 515041)

目的 觀察電針胸部夾脊穴對脊髓損傷后小鼠BMS評分、脊髓中巢蛋白表達和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表達的影響,探討電針的神經保護和運動功能恢復機制。方法 將96只雌性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組、電針組、針刺組,每組24只。除假手術組外,其余3組給予T9水平脊髓損傷,電針組取T7和T11兩對夾脊穴進行電針治療,針刺組取相同的穴位進行單純手針治療。干預每次15 min,每日1次,每5 d休息1 d,共干預28 d。分別于干預后3 d、7 d、14 d、28 d評定各組小鼠的BMS評分變化,酶聯免疫法檢測脊髓中巢蛋白表達,免疫熒光法、蛋白印跡法檢測脊髓中GFAP表達。結果 脊髓損傷后的14 d和28 d,電針組BMS主評分和副評分均明顯高于脊髓損傷組(＜0.05)。在損傷后28 d,針刺組BMS主評分和副評分均高于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05);電針組BMS副評分高于針刺組,差異具有統計學意義(＜0.05)。脊髓損傷后3 d、7 d和14 d電針組的巢蛋白含量明顯增多,與脊髓損傷組相比,差異具有統計學意義(＜0.05)。脊髓損傷后7 d和14 d,針刺組的巢蛋白含量高于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05)。脊髓損傷后3 d和7 d,電針組的GFAP表達明顯高于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05);損傷后28 d,電針組和針刺組對GFAP免疫反應性的抑制強于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05)。結論 電針夾脊穴可以促進脊髓損傷后肢體功能恢復,與電針7 d內促進巢蛋白和GFAP的表達有關,而且二者表達呈正相關。電針治療的早期能促進星形膠質細胞的活化以發揮其神經干細胞的作用,并在后期抑制GFAP的免疫反應性,從而有利于神經功能重塑。

電針;脊髓損傷;巢蛋白;BMS評分;膠質纖維酸性蛋白;小鼠

脊髓損傷可以導致運動功能和感覺功能的缺失,會給患者帶來一系列精神上、社會上以及經濟上的壓力[1]。深入闡釋脊髓損傷的分子機制,尋找出更有效的治療方法,從而提高患者的生活質量,具有深遠的臨床意義。顯而易見,促進脊髓損傷后運動功能的恢復是非常重要的。臨床常用皮質甾類和神經節苷脂等藥物治療脊髓損傷,急性脊髓損傷后常用皮質類固醇激素作為臨床治療的首要干預方法。激素治療對于急性損傷后的抗炎作用明顯,但其對于促進運動功能恢復的臨床意義還存在一定爭議。GM-1神經節苷脂結合物理療法可以促進不完全脊髓損傷后患者運動功能的恢復[2]。然而,迄今為止,由于藥物治療有明顯的副反應、花費高并且用藥周期長,還難以被廣大脊髓損傷患者所接受。近年來,隨著細胞移植以及基因技術的發展,為脊髓損傷后神經功能恢復帶來了新的希望,然而,其作為一種成熟技術應用于臨床還為時過早[3-6]。

針灸作為傳統的中醫藥療法已經普遍應用于臨床多年,針灸可以促進新陳代謝,提高機體免疫力,并且花費低廉,易于操作,沒有任何副反應。研究發現,針灸有利于神經損傷后的神經系統機能恢復[7]。電針在臨床中應用廣泛,針刺同時給予的低頻直流電治療,可以給機體傳導神經沖動,在神經突觸形成和可塑性中扮演著重要的角色。研究表明,電針可以改善脊髓損傷后運動功能及感覺功能的恢復[8]。然而,脊髓損傷后電針治療的分子機制尚需進一步的研究,以便更好地為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取96只清潔級雌性C57BL/6小鼠,體重20～25 g,周齡10～12周,進行適應性喂養1個星期,飼養溫度與濕度分別為(23±2)℃和(60±10)%。動物來源于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心。將小鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組、脊髓損傷＋電針組(電針組)、脊髓損傷＋針刺組(針刺組)。

1.2 主要試劑和儀器

KWD808Ⅰ電脈沖治療儀(廣州英迪電子醫療設備公司),一次性使用無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,中研太和醫藥公司), ELISA試劑盒(武漢博士德試劑公司),冰凍切片機(德國萊卡儀器公司),Axio顯微成像系統(德國蔡司公司),氯胺酮(福建寧德古田制藥公司),甲苯噻嗪(德國西格瑪公司),PBS緩沖液,4%多聚甲醛。

1.3 分組處理

假手術組僅僅給予小鼠椎板切除術。

脊髓損傷組給予小鼠T9水平的不完全脊髓損傷。

電針組給予小鼠T9水平的不完全脊髓損傷,第2日進行電針治療,取穴方法參照《實驗動物學》及《針灸實驗動物圖譜》,選擇T7和T11兩對夾脊穴,針刺后連接KWD808Ⅰ電脈沖治療儀,疏密波(2/100 Hz),強度為0.2 mA,治療15 min,每日1次,每5 d休息1 d,共治療28 d。

針刺組給予小鼠T9水平的不完全脊髓損傷,第2日進行單純手法針刺治療,取穴同電針組,每5 min捻針10 s,每日1次,每5 d休息1 d,共治療28 d。

1.4 灌注與取材

在治療的不同時間點(3 d,7 d,14 d,28 d),將小鼠用異戊烷吸入麻醉后,開胸,輸液針刺入心尖部,灌注0.1 M PBS緩沖液(pH 7.4),剪開左心耳,流出血液沖洗干凈后灌入4%多聚甲醛,直到臟器固定及四肢有僵硬感,或單獨灌注PBS緩沖液,取出脊髓,置于﹣80℃保存,根據實驗安排,分別進行酶聯免疫法、免疫熒光法、蛋白印跡法等測定。酶聯免疫的脊髓組織選擇以損傷處為中心上下端各0.5 cm的脊髓組織。免疫熒光的脊髓組織選擇損傷段以下0.5 cm脊髓組織。蛋白印跡的脊髓組織選擇以損傷為中心包括上下端0.5 cm的脊髓組織。

1.5 觀察指標

1.5.1 BMS行為學評定

BMS主評分和副評分用來評價脊髓損傷后小鼠的運動功能[9-10]。測試由兩個有經驗的研究人員進行操作。BMS主評分由0分(無任何踝部動作)至9分(完全正常的運動能力)組成,BMS副評分總分為11分。分別在脊髓損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d進行BMS行為學評定。

1.5.2 酶聯免疫法

將脊髓組織稱取重量后加入一定量的PBS,勻漿后離心20 min左右(3000 r/min),收集上清,分裝后待檢測,具體操作步驟按照小鼠巢蛋白酶聯免疫分析試劑盒進行。

1.5.3 免疫熒光法

在脊髓損傷后3 d、28 d以4%多聚甲醛灌注取材后,分離脊髓組織以4%多聚甲醛浸泡過夜,次日置于含有30%蔗糖的PB溶液中于室溫擱置1 d進行高滲脫水。次日取出脊髓組織以OCT包埋,冰凍切片機上連續縱向切片(厚度為15mm),0.01 M枸緣酸鈉溶液(pH 6.0)99℃水浴40 min,PBS洗1次,10%驢血清含0.2%的Triton X-100室溫封閉1 h,10%驢血清加入兔抗多克隆膠質酸性纖維蛋白抗體(1:2000)作為一抗,均勻覆蓋于脊髓組織切片上,置于濕盒中于4℃冰箱過夜孵育。次日,棄去未結合的一抗,PBS清洗3次,每次5 min,加入抗一抗種屬來源的紅色熒光二抗(激發光波長為594 nm),置于濕盒室溫孵育1 h。棄去未結合的二抗溶液,PBS清洗3次,每次5 min,加入含有DAPI的PBS溶液,細胞核染色5 min,使用水溶性封片液,蓋玻片封片。

1.5.4 蛋白印跡

RIPA蛋白抽提試劑,加入蛋白酶抑制劑及0.1 M PMSF(比例1:9)。稱取組織以稱重,加入裂解液,電動組織勻漿器15000 r/min轉速進行勻漿,4℃離心,13000 r/min,20 min。離心完成后取上清,分裝保存,待測。以BCA法測蛋白濃度,以RIPA調整蛋白濃度,蛋白煮沸變性10 min。配備12%的分離膠,濃縮膠濃度為5%,待測蛋白樣品上樣量為10mg/孔,電泳條件選擇80～120 V。選擇濕轉法轉膜,轉膜條件為300 mA,時間為3 h,轉膜后麗春紅染色試劑對膜進行染色,觀察轉膜效果。將膜置于3%BSA-TBST中室溫輕搖1 h封閉。將膜以3%BSA-TBST稀釋膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及GAPDH (1:1000)一抗孵育,于4℃冰箱中輕搖過夜。次日, TBST洗膜3次,每次5 min,3%BSA-TBST稀釋抗一抗種屬來源的二抗(1:1000),室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次,每次5 min。ECL顯色液顯色,曝光,使用儀器為alpha凝膠成像系統。

1.6 統計學方法

所有數據由SPSS19.0統計軟件包處理。計量資料以均數±標準差表示,采用單因素方差分析、檢驗。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對脊髓損傷后小鼠BMS評分的影響

由圖1可見,脊髓損傷后的第1天,除假手術組外,其余3組小鼠的BMS評分明顯降低,并在脊髓損傷3 d后開始逐漸增高。在損傷后14 d和28 d,電針組BMS主評分和副評分均明顯高于脊髓損傷組(＜0.05)。在損傷后28 d,針刺組BMS主評分和副評分均高于脊髓損傷組,差異有統計學意義(＜0.05);電針組BMS副評分高于針刺組,差異有統計學意義(＜0.05)。而在其他時間點組別之間無明顯差異。說明電針與針刺均可提高脊髓損傷后小鼠BMS評分,并且電針組優于針刺組。

2.2 電針對脊髓損傷后GFAP表達的影響

免疫熒光法測定GFAP表達結果顯示,脊髓損傷后3 d,與脊髓損傷組比較,電針組損傷部位出現明顯的神經膠質增多(圖2A),脊髓損傷組GFAP表達增多,電針組GFAP表達高于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05);脊髓損傷后28 d,電針組和針刺組GFAP表達明顯低于脊髓損傷組,差異有統計學意義(＜0.05) (圖2B)。蛋白印跡法測定GFAP表達結果顯示,脊髓損傷后3 d和7 d,電針組GFAP表達明顯高于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05);損傷后28 d,電針組和針刺組對GFAP免疫反應性的抑制強于脊髓損傷組,差異具有統計學意義(＜0.05)(圖2C、D)。

注:電針組與脊髓損傷組比較1)P＜0.05;針刺組與脊髓損傷組比較2)P＜0.05;電針組與針刺組比較3)P＜0.05

注:電針組與脊髓損傷組比較1)P＜0.05;針刺組與脊髓損傷組比較2)P＜0.05

2.3 電針對脊髓損傷后脊髓中巢蛋白表達的影響

脊髓損傷組小鼠巢蛋白含量在脊髓損傷后7 d開始增高并在損傷后14 d出現降低。與脊髓損傷組相比,脊髓損傷后3 d、7 d和14 d電針組的巢蛋白含量明顯增多,差異有統計學意義(＜0.05)。脊髓損傷后7 d和14 d,針刺組的巢蛋白含量高于脊髓損傷組,差異有統計學意義(＜0.05)。然而,脊髓損傷后28 d,除了假手術組,各組巢蛋白含量減少,并且3組之間比較差異無統計學意義(＞0.05)。詳見圖3。

注:電針組與脊髓損傷組比較1)P＜0.05;針刺組與脊髓損傷組比較2)P＜0.05

3 討論

根據中醫學的臟腑經絡理論,脊髓損傷的病理學基礎為督脈損傷。傳統中醫學認為,華佗夾脊穴位于脊柱兩旁,內夾督脈,外貫足太陽膀胱經,一方面可以通暢脊背經氣,一方面可以通過督脈及多血少氣之膀胱經發揮調節全身氣血的作用[11-12]?，F代中醫學以夾脊穴的解剖學位置為基礎,以脊椎與神經的節段性分布關系為依據,選取相應的夾脊穴治療該節段神經支配的相關病癥,并取得良好療效。研究表明,電針夾脊穴治療對中樞神經系統損傷、椎間盤病變、相應臟器病變起到良好療效。研究發現,電針夾脊穴可以提高脊髓損傷后大鼠下肢的BBB評分,縮短皮層體感誘發電位潛伏期,促進神經損傷的功能恢復[13]。電針夾脊穴對脊髓損傷后表皮生長因子、NG2蛋白等多種分子的表達起到促進作用[14-15]。然而,電針夾脊穴對脊髓損傷后的分子機制研究尚需進一步明確?；诖?我們建立脊髓損傷小鼠模型,選擇以脊髓損傷段為中心的上下兩組夾脊穴進行電針治療。

電針能夠對機體產生神經沖動,在突觸形成和穩定性中發揮著重要作用。前期研究表明,電針可以調節脊髓損傷后神經生長因子和炎性因子的表達從而促進神經再生[16-18]。本研究中,課題組再次證實電針和針刺均可促進脊髓損傷后下肢運動功能的恢復,并且電針組療效優于針刺組。課題組選擇疏密波(2/100 Hz)作為電針波形,能夠克服由單一波形帶來的機體易適應性。

巢蛋白是神經干細胞的標記蛋白,和細胞分化密切相關[19]。本研究發現,在脊髓損傷后的早期(脊髓損傷后3 d、7 d),電針可以促進大量的巢蛋白表達。損傷后14 d,電針組和針刺組的巢蛋白含量出現降低,但仍然高于脊髓損傷組(＜0.05)。結果表明,電針對脊髓損傷后早期發揮著促進神經元分化和增殖的作用。因此,電針激活成年哺乳動物的神經干細胞功能極有可能在神經細胞再生和組織修復的過程中發揮重要作用。GFAP僅存在于星形膠質細胞,并促進神經元生長[20]。在成年哺乳動物中,GFAP對神經系統起到支持、營養、隔離和保護的作用。星形膠質細胞的過度激活會引起疾病的發生。逐漸地,星形膠質細胞的過度肥大、增殖和遷移促進神經膠質瘢痕形成[21-23]。神經膠質瘢痕形成的越多,對損傷后神經恢復的阻礙就越大。本次研究結果顯示,GFAP的免疫反應性表明在脊髓損傷后早期(脊髓損傷后3 d、7 d),電針促進星形膠質細胞活化,而在損傷的后期(脊髓損傷后28 d),電針促進星形膠質細胞活化水平降低。

GFAP和巢蛋白的表達正相關,電針對二者作用相似,共同促進損傷后神經功能的重建。本研究發現,電針可以促進星形膠質細胞的形成從而在神經干細胞中發揮作用。然而,電針對神經損傷后神經保護的具體分子機制還有待于進一步闡述。

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Mechanism Study on Electroacupuncture in Reconstructing the Neurologic Function in Mice after Spinal Cord Injury

1,2.

1.,,323000,; 2.,,515041,

Objective To observe the effect of electroacupuncture at thoracic Jiaji points (EX-B 2) on the Behavior Measurement Scale (BMS) score, and expressions of nestin and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in spinal cord in mice after spinal cord injury, and to explore the action mechanism of electroacupuncture in protecting nerves and recovering motor function. Method Ninety-six female C57BL/6 mice were randomized into a sham operation group, a spinal cord injury group, an electroacupuncture group, and an acupuncture group, 24 mice in each group. Except for the sham operation group, spinal cord injury at T9level was induced in the other three groups. The electroacupuncture group was intervened by electroacupuncture at Jiaji points (EX-B 2) of T7and T11, and the acupuncture group received manual acupuncture at the same acupoints. The intervention was conducted 15 min each time, once a day, with 1 d interval every 5 d, for a total of 28 d. The BMS score was evaluated respectively after 3 d, 7 d, 14 d, and 28 d intervention. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to detect the expression of nestin in spinal cord, and immunofluorescence and Western blotting were used to detect the expression of GFAP in spinal cord. Result Respectively 14 d and 28 d after spinal cord injury, the main and auxiliary scores of BMS in the acupuncture group were significantly higher than those in the spinal cord injury group (＜0.05); 28 d after spinal cord injury, the main and auxiliary scores of BMS in the acupuncture group were significantly higher than those in the spinal cord injury group (＜0.05) and the auxiliary BMS score in the electroacupuncture group was significantly higher than that in the acupuncture group (＜0.05). Respectively 3 d, 7 d, and 14 d after spinal cord injury, the contents of nestin in the electroacupuncture group were obviously increased and significantly different from those in the spinal cord injury group (＜0.05). The nestin content of the acupuncture group was significantly higher than that of the spinal cord injury group 7 d and 14 d after spinal cord injury (＜0.05). The expression of GFAP in the electro- acupuncture group was significantly higher than that in the spinal cord injury group 3 d and 7 d after spinal cord injury (＜0.05); the inhibitions on the immunoreactivity of GFAP in the electroacupuncture group and acupuncture group were more significant than the inhibition in the spinal cord injury group 28 d after the injury (＜0.05). Conclusion Electroacupuncture at Jiaji points (EX-B 2) can promote the recovery of motor function after spinal cord injury, which is related to the enhancement of the expressions of nestin and GFAP within 7 d after the injury, and the two expressions are in a positive correlation. In the early stage of treatment, electroacupuncture can boost the activity of astrocytes to act as neural stem cells and inhibit the immunoreactivity of GFAP in the later stage to benefit the reconstruction of neurologic function.

Electroacupuncture; Spinal cord injury; Nestin; BMS; Glial fibrillary acidic protein; Mice

1005-0957(2017)05-0608-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0608

國家自然科學基金青年科學基金項目(81503639);黑龍江省自然科學基金面上項目(H2016070)

衛哲(1981—),女,副主任醫師,博士后,Email:weizhe315@126.com

2016-11-24