玉米FLA蛋白家族的生物信息學分析

鐘靜+胡穎+陳亞波+宋群星

摘要：類成束阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins，簡稱FLAs）是一類廣泛分布于植物體內的富含羥脯氨酸的糖蛋白，在植物生長發育和形態構建中發揮著重要作用。基于已公布的玉米蛋白數據庫確定了26個FLA蛋白，并對其理化性質、系統發生樹、蛋白結構和功能域等進行了分析。結果表明，FLA蛋白氨基酸長度在249～682個之間，理論等電點在4.99～10.76之間，主要定位在質膜上，多數為疏水性蛋白；二級結構由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等元件組成；部分蛋白空間結構具有較強保守性。

關鍵詞：玉米；FLA；蛋白家族；基因家族；生物信息學；理化性質；結構特征

中圖分類號： Q943.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0023-05

阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan proteins，簡稱AGPs）是一類富含羥脯氨酸的糖蛋白[1]。根據核心蛋白骨架差異，AGPs被分為經典AGPs（classical AGPs）、非經典AGPs（non-classical AGPs）、賴氨酸富集AGPs（lysine-rich AGPs）、AG多肽（AG peptides）、類成束蛋白AGPs（fasciclin-like arabinogalactan proteins，簡稱FLAs）、類木質形成素AGPs（xylogen-like AGPs，簡稱XLAs）和類植物藍素AGPs（phytocyanin-like AGPs，簡稱PLAs）等7類[2-4]。AGPs的蛋白骨架一般包括N端信號肽和1段長度可變且富含脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）的區域（PAST）[1]。經典AGPs還包含1個C端GPI錨定信號。FLAs作為AGPs的1個亞類，除具有AGPs的典型結構之外，還含有1～2個成束蛋白結構域（fasciclin domains，簡稱FAS）[5]。

FLAs在植物生長發育過程中發揮重要作用。有研究顯示，FLAs參與了莖、側根、花粉小孢子發育，以及棉花纖維細胞的伸長等過程[6-8]，此外還可影響植株莖的強度和彈性[9]。對其作用機制的研究表明，FLAs可能是通過影響細胞壁的形成從而發揮其生物學功能[10-13]。目前已經在擬南芥、油菜、水稻、小麥中分別鑒定出了21、33、27、34個FLAs[3，5，14-15]，但是在重要的糧食和經濟作物玉米中還未見關于FLAs的報道。因此，本研究采用生物信息學方法，對玉米FLAs蛋白家族成員進行全面的鑒定和系統進化分析，并進一步分析其蛋白質產物的理化性質、結構特征和功能域等特點，以期為進一步揭示植物FLAs的結構和功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1序列來源

分別從Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）、Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）數據庫中下載玉米中含有FAS結構域的蛋白序列[16-17]。將獲得的序列提交到maizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）數據庫中進行比對，獲得目標蛋白質的全長序列。從擬南芥官方數據庫TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）中下載獲得擬南芥FLAs基因和蛋白序列數據。

1.2序列分析

利用Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算相對分子量及理論等電點。利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、Plant- mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析蛋白信號肽和亞細胞定位[18]。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析蛋白親水性/疏水性。利用NPS（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_hnn.html）分析蛋白質的二級結構。利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質的三級結構。

1.3模體識別

利用MEME program3（http：//meme-suite.org/）模體搜索工具識別FLAs家族相關蛋白質所共有的模體，并對相關參數進行修改，將可找到的模體數最大值調整為15個，每個模體的最大寬度調整為100，其他均為默認值[19]。

1.4系統進化樹的構建

應用多序列比對工具ClustalX 1.83對玉米、擬南芥FLAs氨基酸全序列進行比對[20]。采用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，簡稱NJ）構建系統發育樹[21]。通過隨機逐步比較的方法搜索最佳系統進化樹，對生成的系統樹進行Bootstrap校正。

2結果與分析

2.1玉米FLAs家族成員的鑒定和理化性質分析

分別從Pfam、Interpro數據庫下載玉米中含有FAS結構域的蛋白序列，并將獲得的序列分別提交到maizeGDB數據庫中進行比對，獲得其全長序列。對來源于2個數據庫中的蛋白質全長進行交叉比對，去除重復序列。進一步將獲得的蛋白序列提交到SignalP 4.1檢測N端信號肽，不含有信號肽的不屬于AGPs家族。對含有信號肽的序列手動查找其中富含PAST的區域，并將蛋白序列提交到PSORT檢測C端糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定信號，最終獲得了26個玉米FLAs并分別命名為 ZmFLA1～ZmFLA26（表1）。

對這26個ZmFLAs進行氨基酸理化性質分析表明，氨基酸序列長度在249～682個之間，分子量在25 175.47～72 410.16 u 之間，理論等電點在4.99～10.76之間（表1）。亞細胞定位分析顯示，絕大多數ZmFLAs都定位在質膜上，其中 ZmFLA8、ZmFLA14除定位在質膜上外，還可能定位在核中，而ZmFLA5則僅定位在核上（表1）。親水性/疏水性分析顯示，ZmFLA2/6/24 親水區域明顯大于疏水區域，說明這3個 ZmFLA 蛋白親水性較強，為親水性蛋白；其余23個 ZmFLA 蛋白為疏水性蛋白（表1）。N-糖基化位點檢測結果顯示，所有 ZmFLAs 都至少含有1個N-糖基化位點，ZmFLA22 甚至包含7個N-糖基化位點（表1），說明ZmFLAs蛋白骨架可能具有較高的糖基化修飾率。

2.2ZmFLAs系統進化和序列特異性分析

對玉米、擬南芥中的FLAs進行系統進化分析顯示，26個ZmFLAs、21個AtFLAs被聚類在8個獨立的進化分支中（圖1-A）。分支Ⅷ僅含有2個AtFLAs，其余7個分支都同時有ZmFLAs、AtFLAs的分布。但是在同一分支中的ZmFLAs、AtFLAs 并無明顯交叉分布，來源于不同物種的FLAs通常分別聚類在小的分支中。例如分支Ⅱ含有2個擬南芥FLAs、5個玉米FLAs，其中AtFLA1、AtFLA2聚類在1個小分支中，而ZmFLA4/10/19聚類在另1個小分支中。進一步的序列特異性分析顯示，盡管玉米、擬南芥的FLAs都含有模體1，但是不同的FLAs含有其他不同的模體。同時，處于同一個進化分支中的FLAs往往具有類似的模體。例如進化分支Ⅰ中，AtFLA3/5/14、ZmFLA14都含有模體1、模體7、模體8、模體11，ZmFLA12/16/25則含有模體1、模體8、模體11；模體10僅出現在分支Ⅱ、Ⅲ的蛋白質序列中，而模體4、模體5、模體9僅出現在分支Ⅴ中（圖1-B）。

2.3ZmFLAs蛋白結構分析

通過NPS程序對這26個ZmFLAs蛋白序列進行二級結構分析表明，蛋白質均由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等結構元件組成，但是這3種元件的比例和分布存在差異。其中無規則卷曲所占比例最高，在38.05%～58.97%之間；其次為 α-螺旋，在25.93%～46.83%之間；延伸鏈所占比例最低，在8.86%～21.63%之間（表2）。進一步利用Swiss-Model同源建模的方法預測這26個ZmFLAs蛋白的三級結構。從圖2可以看出，三級結構主要是由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等元件組成，其中ZmFLA1/2/3/7/13/17/22/23/24空間結構較為保守；ZmFLA8/12/14/16/18/19/25與這些蛋白類似，但是空間結構明顯較為松散；其余ZmFLAs的結構則與上述蛋白存在明顯差異，其中ZmFLA5/10/11/20結構較類似。

3結論與討論

本研究通過多種數據庫和在線軟件，對玉米FLA蛋白基因家族進行了全面的鑒定和分析。結果顯示，從玉米全基因組中共鑒定出了26個FLAs，對其理化性質的研究顯示，大多數ZmFLAs都是疏水性氨基酸。亞細胞定位預測結果顯示，絕大多數ZmFLAs定位在質膜上，這可能與FLAs參與細胞間信號轉導有關[13]。系統進化分析結果顯示，玉米、擬南芥FLAs被聚類在8個獨立的進化分支中，每個進化分支中都有玉米、擬南芥FLAs蛋白的分布，暗示在單子葉、雙子葉植物中，該家族成員可能擁有共同的祖先。但是，在每個進化分支中，不同物種來源的FLAs蛋白并沒有呈現交叉分布，這說明該蛋白基因家族的擴張可能是發生在單子葉、雙子葉植物進化之后，并且其擴張在單子葉、雙子葉植物中是獨立進行的。

目前認為，蛋白質的一級結構決定二級結構，二級結構又決定著三級結構，而蛋白質的功能往往取決于其空間結構。本研究對26個ZmFLAs的結構進行了分析。二級結構分析結果表明，ZmFLAs蛋白包含α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等元件。其中無規則卷曲所占比例最高，α-螺旋次之，延伸鏈比例最低。同時，各個ZmFLAs中不同元件的比例和分布也存在差異。進一步的三級結構分析表明，盡管部分 ZmFLAs 的空間結構十分保守或者類似，但是其拓撲結構和聚合角度也存在明顯差異，這暗示不同的ZmFLAs可能具有各自獨特的功能。

已有關于FLAs的報道主要集中在雙子葉模式植物擬南芥中，鮮見對單子葉經濟作物中FLAs生物學功能的相關報道。本研究應用生物信息學的方法鑒定了玉米FLAs蛋白家族成員，并對FLAs的基本理化性質、亞細胞定位、系統進化、二級結構和三級結構等進行了詳細分析，以期為深入探討ZmFLAs的生物學功能提供理論基礎。

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