穿心蓮染色體制片優化及核型分析

馬婷玉+李明+吳燕燕+段修冉+潘麗萍

摘要：采用常規壓片法進行穿心蓮染色體制片方法及其染色體數量和核型分析的研究。結果表明，08：00—8：30取材較佳，以0.10%秋水仙素溶液作為預處理液，預處理2 h，在1.0 mol/L鹽酸溶液中于60 ℃恒溫解離8 min，低滲 15 min 后，卡寶品紅溶液染色25 min壓片鏡檢，所得穿心蓮染色體制片效果良好。穿心蓮體細胞染色體數量為2n=2x=48。首次報道了穿心蓮核型公式為2n=2x=48=14m+22sm+12st，其中中部染色體（m）為7對，近中部著色點染色體（sm）為11對，近端部著色點染色體（st）為6對，核型不對稱系數為67.61%，核型屬3B型。

關鍵詞：穿心蓮；染色體；制片技術；核型分析

中圖分類號： S567.21+9.02文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0033-04

穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]屬爵床科穿心蓮屬一年生草本植物，具有抗病毒、抗腫瘤等作用，在國內外有廣闊的市場和開發前景。我國穿心蓮最早在廣東省和福建省南部引種栽培，目前主產地為廣東、廣西、海南、福建等?。▍^）[1]。穿心蓮主要以田間栽培為主，我國野生資源較少，而在穿心蓮長期人工栽培生產中存在品種退化、產量和質量下降等問題，亟須進行新品種選育研究[2-3]。

目前，國內外對穿心蓮的研究主要為種質資源調查與質量評價[2-3]、組織培養與栽培[4-5]、藥用成分分析[6]、分子標記技術[7]等，對穿心蓮細胞遺傳學方面的研究較少。本研究進行染色體制片方法優化及核型分析，旨在為穿心蓮遺傳資源保護、優良種質選育和利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

供試穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]種子由廣東省清遠市穿心蓮中藥材生產質量管理規范（GAP）基地提供，染色體憑證玻片存放于廣東藥科大學中藥資源系植物細胞與組織培養實驗室。

1.2方法

1.2.1種子萌發試驗參照李玲梅等的方法[8]，擇顆粒飽滿的穿心蓮種子，用清水沖洗后用0.1% KMnO4溶液浸泡 30 min 取出，用無菌水沖洗，置于鋪好的裝有滅菌濾紙的培養皿中，在 25 ℃ 恒溫培養箱中進行暗培養，胚根長至0.5～0.8 cm時切取根尖。

1.2.2不同取材時間的有絲分裂中期分裂相數比較于07：30—11：00每隔30 min取穿心蓮胚根根尖，以0.05%秋水仙素處理3 h，并對不同視野下單位面積內的中期分裂相進行計數，以確定穿心蓮胚根根尖的中期分裂高峰期和適宜的取材時間。

1.2.3預處理與固定取穿心蓮胚根根尖區域，置于4種預處理液中進行不同時間預處理：（1）0.05%秋水仙素溶液；（2）0.10%秋水仙素溶液；（3）0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液；（4）0.10%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合溶液（體積比1 ∶1）分別在避光條件下處理1、2、3 h。取出經預處理的根尖，用蒸餾水沖洗2～3次，然后轉入卡諾固定液（無水乙醇 ∶冰醋酸體積比=3 ∶1）中固定24 h。

1.2.4解離取固定后的根尖，于60 ℃恒溫水浴中用 1.0 mol/L HCl解離5、8、9、10、11、15 min，取出經解離的根尖，沖洗2～3次后轉移至蒸餾水中，室溫下低滲處理15 min，然后經85%乙醇處理2～3 min，4 ℃保存備用。

1.2.5染色與壓片取出根尖，只保留分生區，置于清潔的載玻片上，滴加2滴20%卡寶品紅溶液，染色25 min，吸去染液，滴加稀甘油，采用常規壓片法制片。

1.2.6染色體核型分析常規法壓片后，選取分散較好的染色體裝片于ZEISS Axioplan 2顯微鏡，在AxioVision 4.6圖像分析系統下鏡檢與拍照，采用MetaSystems Ikaros軟件系統進行染色體長臂和短臂測量，并進行染色體配對和核型分析。

篩選出最佳染色體制片方法，從最優的染色體制片中選取50個以上可準確計數的根尖有絲分裂中期相細胞，其中85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數，即可認為是穿心蓮的染色體數[9-10]。核型取5個典型中期細胞的平均值，參照Kuo等提出的方法[11]計算染色體相對長度指數（I.R.L）；根據Levan等提出的方法[12]進行染色體類型分析；參照Stebbins提出的方法[13]進行染色體核型分析和相關參數計算；核型不對稱系數（As.K）按Arano提出的方法[14]計算。

2結果與分析

2.1不同取材時間對穿心蓮根尖細胞中期分裂相的影響

表1結果顯示，穿心蓮有絲分裂中期分裂相高峰期在 08：00—08：30，可觀察到約24%～28%的中期細胞；其他時間也能觀察到中期分裂相細胞，但所占比例較小，說明穿心蓮根尖細胞分裂有周期性，因此08：00—08：30的穿心蓮根尖細胞處于有絲分裂中期的比例較高，該時間點適于取材。

2.2不同預處理方法對染色體制片的影響

由表2和圖1可知，隨處理時間延長，同一預處理單位視野中的中期分裂相數量隨處理時間先增加后減少，染色體長度逐漸聚縮，說明預處理液對染色體長度的影響隨時間延長而加劇。其中，以 0.10% 秋水仙素處理2 h后處于中期分裂相的細胞數量最多，染色體聚縮適中，分辨程度清晰，適合作核型分析（表2、圖1-a）；材料經0.10%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶1混合液處理2 h后，染色體呈點狀，形態模糊（圖1-b）；經0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2 h后，染色體聚縮不足，大部分有拖尾現象（圖1-c）；而經0.05%秋水仙素處理2 h后，染色體雖然較為分散，但有部分拖尾現象，因觀察到較多中期分裂相細胞，只適合用于計數（圖1-d）。4種預處理液的整體效果為010%秋水仙素溶液>0.05%秋水仙素溶液>0.10%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶1混合液>0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液。比較40×10倍視野中中期分裂相細胞平均數量和染色體的聚縮程度發現，0.10%秋水仙素溶液預處理2 h可得到理想的穿心蓮染色體制片效果。

2.3不同解離時間對染色體制片的影響

由表3、圖1可知，1.0 mol/L鹽酸溶液60 ℃恒溫水浴中解離8 min細胞胞壁完全脫落，壓片時細胞分散性最好；解離時間過短的胚根根尖軟化程度不夠，細胞排列較緊密，染色體過度聚集，壓片時不易使細胞處于同一平面上，給后期鏡檢和計數帶來困難（圖1-e）；解離時間過長的細胞，過度軟化不易染色，且細胞易破裂，染色體分散過度，不利于統計，影響核型分析的精確度（圖1-f）。

2.4染色體數量分析

通過統計50個有效的穿心蓮中期分裂相細胞，其染色體數量有46、47、48條，其中86%的細胞具恒定一致的染色體數48條，根據李懋學等提出的標準[10]，確定穿心蓮的染色體數量為48條，將48條染色體配對成24對，核型和核型模式見圖2、圖3。

2.5染色體相對長度及核型分析

對5個有效細胞的核型進行分析，取平均值，穿心蓮染色體分為4組：1～4號為長染色體（L），5～7號為中長染色體（M2），8～21號為中短染色體（M1），22～24號為短染色體（S）；其中1、2、4、5、6、7、10號為中部著絲粒染色體（m），3、8、11、13、14、15、16、17、18、19、24號為近中部著絲粒染色體（sm），9、12、20、21、22、23號為近端部著絲粒染色體（st），詳見表4。核型公式為2n=2x=14m+22sm+12st，染色體相對長度在2.959%～7.101%之間，平均相對長度為4.17%，染色體長度比為2.40，臂比大于2 ∶1的染色體占66.7%，按照STEBBINS的核型分類標準，穿心蓮的核型屬3B型，是不對稱性較高的染色體組，核型不對稱系數為67.61%，染色體核型分析參數見表4。

3結論與討論

植物中具有分生能力的部位都可作為觀察細胞染色體的材料，如根尖、莖尖、愈傷、嫩葉、花粉母細胞等[15]。不同植物的分裂旺盛部位應視植物自身生長特性而定，在選取材料時間的對照試驗中，因外界環境、植物自身生長調控等因素影響，取材時間也不同，如翠蘆莉（Ruellia brittoniana Leonard）和大花蘆莉（Ruellia elegans Poir.）的幼根于8：00—10：00取材中期分裂相細胞最多[16]；木薯（Plumbago auriculata）嫩葉在08：30—10：00取材效果最佳[17]。為保證植物細胞處于較旺盛的中期分裂相，本研究選08：00—8：30取穿心蓮胚根根尖，可能是因為穿心蓮種子根尖在該時間段分裂較旺盛。

要獲得準確的結果，合適的預處理濃度和處理時間是制片的關鍵。有學者認為小染色體植物的染色體用秋水仙素溶液作預處理效果較佳[18]。李懋學等提出了多種小染色體植物的制片方法，如大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）等宜用0.002 mol/L 8-羥基喹啉水溶液作預處理液[10]。本試驗對比不同預處理液和處理時間的制片效果后認為，選用穿透力較強的0.10%秋水仙素溶液處理2 h后，穿心蓮染色體聚縮程度適中，著絲粒位置適中，而處理3 h的染色體過度收縮，很難進行染色體的形態分析。0.05%秋水仙素溶液可能是因濃度較低而影響其穿透力，只適合用于計數不適合作核型分析。而使用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預處理穿心蓮根尖細胞，得到的染色體聚縮程度不足，染色體形態有拖尾不易分辨，推斷其原因為穿心蓮的染色體較?。?～4 μm），但是細胞壁較厚且細胞質較濃，當使用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預處理時，難以有效穿透較厚的細胞壁。0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液（體積比1 ∶1）混合液處理下染色體聚縮過度，其可能原因是2種預處理液對紡錘絲的抑制效果不同，而造成抑制作用疊加使染色體過度聚縮。解離常用酶解法和酸解法，酶解法成本較高且混合酶液濃度視不同植物而定，酸解法通常在60 ℃鹽酸中恒溫水浴，成本低且易操作。最終本試驗確定8：00—8：30為較宜的取材時間，穿心蓮根尖以0.10%秋水仙素溶液預處理2 h，卡諾氏液固定24 h，1.0 mol/L 鹽酸溶液60 ℃下解離8 min后低滲 15 min，卡寶品紅染色25 min，顯微鏡視野內觀察到較清晰的穿心蓮染色體。

穿心蓮染色體數量目前國內外僅有陳愛葵等報道，為 2n=12，關于所用廣東省云浮市栽培種穿心蓮的來源有待于進一步探討[19]。陳瑞陽報道采自中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所的穿心蓮染色體為2n=50[20]。本研究中采自廣東省清遠市的穿心蓮染色體數量經過反復統計和驗證后，確定為2n=48，與陳瑞陽的結果[20]略有差異。自然環境和氣候條件可能是造成植物形態學和細胞學差異的主要原因，從而使染色體數量存在一定差異。在一定的生存環境中，植物的染色體是恒定的，但生存環境的差異會增加物種的遺傳多樣性。

在染色體核型方面，穿心蓮的核型不對稱系數為 67.61%，核型分類為3B型，Stebbins認為系統演化中較原始的植物通常具有較對稱的核型，而較進化或特化的植物往往出現不對稱的核型，核型不對稱系數越大，染色體長短臂越不對稱，其進化程度越高[13]。按Stebbins提出的核型分類標準，穿心蓮在爵床科穿心蓮屬植物的系統演化中進化程度較高。

本研究確定了穿心蓮的染色體數量，并對其進行了核型分析，為進一步研究穿心蓮屬植物的進化、植物分類、遺傳育種、優良品種選育提供了細胞學資料。

參考文獻：

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M]. 北京：科學出版社，2002：204-205.

[2]陳元生，羅戰勇，郭尚志，等. 穿心蓮種質資源的評價與利用初報[J]. 廣東農業科學，2005，12（1）：5-7.

[3]鄧喬華，徐友陽，李淑苑，等. 影響穿心蓮藥材質量因素的調查和研究[J]. 現代中藥研究與實踐，2009，23（5）：5-7.

[4]賀紅，黃昌杰，劉昌輝，等. 穿心蓮不同外植體離體培養的研究[J]. 廣州中醫藥大學學報，2004，21（6）：470-472.

[5]黃海波，徐鴻華. 穿心蓮規范化栽培技術[M]. 廣州：廣東科技出版社，2010：2-9.

[6]曾令杰，梁暉，林蔚蘭. 穿心蓮生長過程中內酯類成分的積累動態及其相關性研究[J]. 中國現代應用藥學，2007，24（6）：464-467.

[7]陳蓉，王曉云，宋毓寧，等. 基于SRAP和SNP分子標記的國內穿心蓮遺傳多樣性分析[J]. 中國中藥雜志，2014，39（23）：4559-4565.

[8]李玲梅，李明. 不同處理方法對穿心蓮種子萌發影響的初步研究[J]. 廣東藥學院學報，2011，27（4）：371-374.

[9]李國珍. 染色體及其研究方法[M]. 北京：科學出版社，1985：23-35.

[10]李懋學，張贊平. 作物染色體及其研究技術[M]. 北京：中國農業出版社，1996：1-40.

[11]Kuo S T，Wang T T，Huang T C. Karyotype analysis of some Formosan gymnosperms[J]. Taiwania，1972，17（1）：66-80.

[12]Levan A，Fredga K，Sandberg A A.Nomenclacture forcentromeric position on chromosomes [J]. Hereditas，1964，52（2）：197-201.

[13]Stebbins G L. Chromosome evolution in hingher plants[M]. London：Edward Arnoldy Ltd，1971：85-104.

[14]Arano H L.Cytological studies in subfamily Carduoideae（Compositae） of Japan Ⅸ[J]. Botanical Magazine （Tokyo），1963，76：32-39.

[15]趙晨宇. 藍花丹染色體核型分析研究[D]. 雅安：四川農業大學，2013：13-14.

[16]蔡文燕，周桃鳳. 翠蘆莉與大花蘆莉染色體核型分析[J]. 江蘇農業科學，2012，40（5）：134-137.

[17]張健，郭軍輝，陳雄庭，等. 木薯葉片染色體制片技術研究[J]. 熱帶作物學報，2012，33（1）：20-23.

[18]劉永安，馮海生，陳志國，等. 植物染色體核型分析常用方法概述[J]. 貴州農業科學，2006，34（1）：98-102.

[19]陳愛葵，沈育君，廖紅云. 穿心蓮的染色體核型分析初報[J]. 廣東第二師范學院學報，2002，22（2）：57-58.

[20]陳瑞陽. 中國主要經濟植物基因組染色體圖譜（第五冊）[M]. 北京：科學出版社，2005：4-5.