紫花苜蓿的抗菌肽基因Rev4遺傳轉化

武慧+宋明霞+寧思淇+武翠玲+周曉馥

摘要：抗菌肽是機體先天免疫的重要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第1道屏障。Indolicidin是一個13氨基酸殘基肽，從牛的嗜中性粒細胞的胞漿小顆粒分離而來，具有廣譜抗菌性，Rev4是其人工設計的反向序列。利用經典葉盤法，以根癌農桿菌A.GV3850介導紫花苜蓿遺傳轉化，GUS瞬時表達檢測轉化體系建立成功；壓力篩選后葉片基因組DNA的PCR成功檢測到抗菌肽基因條帶，PCR產物回收測序得到13株轉化紫花苜蓿。

關鍵詞：紫花苜蓿；抗菌肽；遺傳轉化

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0044-03

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為四倍體異花授粉的多年生草本植物，屬于豆科苜蓿屬，基因組大，是很好的水土保持植物與綠肥植物，在世界范圍內廣泛種植，以“牧草之王”著稱[1]。長期以來，人們圍繞經濟有效地提高紫花苜蓿產量和品質兩大目標進行了不懈的努力[2-3]，但由于傳統的紫花苜蓿育種方法時間長、成本高且可利用的種質資源有限，基因工程的方法更具有科學性和準確性[4]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物體天然免疫的重要組成部分，是機體抵御外源致病菌的第1道屏障，由于其獨特且多樣的生物學功能和作用機制，引起了科學界的廣泛關注和研究[5]。抗菌肽是自然進化的產物，它可以干擾病原微生物，使其細胞膜結構發生改變，通透性增加，進而起到殺菌作用，又因病原體不易對其產生抗藥性，因此成為新型高效的抗生素替代品[6]。目前，人們一方面研究抗菌肽在先天免疫中發揮作用的機制，一方面設計新型抗菌、抗感染的抗菌肽制劑[7]，抗菌肽研究前景非常廣闊。

Indolicidin是一個13殘基肽（IL-PWKWPWWPWRR-NH2），從牛的嗜中性粒細胞的胞漿小顆粒分離而來，具有廣譜的抗菌和抗病毒活性[8]。針對外源抗菌肽基因轉入植物體內容易被消化分解的不足，有人設計了抗菌肽Indolicidin的反向序列Rev4，合成的反向肽仍然有高的抗菌活性，且相比其他的抗菌肽，對植物蛋白酶的穩定性更高[9]。本研究利用經典葉盤法，以根癌農桿菌A.GV3850介導紫花苜蓿遺傳轉化，GUS瞬時表達檢測轉化體系建立成功；壓力篩選后葉片基因組DNA的PCR成功檢測到抗菌肽基因條帶，PCR產物回收測序得到13株轉化紫花苜蓿。本研究提高紫花苜蓿自身抗病性，紫花苜蓿作為綠色飼料具有重大的生態和社會效益。

1材料與方法

1.1植物材料

供試紫花苜蓿種子為吉林省農業科學院惠贈，吉林師范大學資源科學與綠色生產吉林省重點實驗室保存。

1.2菌種和質粒

根癌農桿菌菌株A.GV3850-pKLP36.PcRIL（149）的pKLP36質粒上含有抗菌肽基因，根癌農桿菌 A.GV3850-PKYLX35S2（194）中含有gus基因。以上2種菌株均由美國邁阿密大學惠贈。

1.3PCR擴增引物序列

以Primer 5.0軟件設計正向引物AnF和反向引物AnR。具體序列如下：AnF：5′-CACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTCTTTTCAC-3′；AnR：5′-GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGGCCATTTC-3′。

1.4試驗試劑

GUS染色液，FAA固定液，離心柱瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Premix Ex Taq Version 2.0為TaKaRa公司產品，低熔點瓊脂糖為Sigma公司產品，X-Gluc、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）試劑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）為BBI公司產品，其他國產試劑購自北京鼎國生物公司。

1.5主要儀器設備

德國QIAGEN高通量組織研磨儀，美國Quawell超微量紫外分光光度計（UV-Vis Spectrophotometer Q5000），HC-2518R高速冷凍離心機，紫外凝膠電泳成像系統，Agilent溫度梯度PCR擴增儀，Nikon熒光體式顯微鏡等。

1.6試驗方法

1.6.1根癌農桿菌A.GV3850介導的苜蓿遺傳轉化將苜蓿組培苗葉片預培養3 d后，分別轉入D600 nm為0.5的根癌農桿菌149和194菌液中，26 ℃、166 r/min振蕩培養 15 min；倒掉菌液，無菌水沖洗3次，置于共培養培養基，25 ℃黑暗條件下，共培養3 d。

葉片轉接到Kan壓力篩選培養基上培養30 d，獲得抗性植株；待抗性植株長到2～3 cm，切段后置于1/2 MS培養基中擴繁，智能人工氣候箱中培養。

1.6.2轉化植株的GUS表達檢測取194侵染后5 d的轉化葉片制成徒手切片，非轉化植株葉片作為對照；取1 mL染色液放入2 mL 離心管中，將準備好的葉片浸泡在染液中，抽真空5 min，37 ℃過夜；取出染液，加入800 μL FAA固定液，顛倒混勻，倒掉，重復2次；依次加入30%、75%、95%乙醇，進行脫色，至陰性對照呈黃白色，倒掉95%乙醇，加入FAA固定液；壓片后以Nikon熒光體式顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6.3轉化植株的PCR分子檢測取149轉化的苜蓿葉片，研磨后加入250 μL CTAB提取緩沖液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH值為8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，3% PVP）和10 μL β-巰基乙醇，65 ℃溫浴；加入體積比為25 ∶24 ∶1的酚、三氯甲烷、異戊醇，混勻后 4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清，無水乙醇醇沉1 h后離心30 min，75%乙醇洗滌沉淀2次；水酶混合液消化RNA；瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR反應為25 μL體系，其中含12.5 μL Premix Ex Taq，正向引物AnF 1 μL，反向引物AnR 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

1.6.4PCR產物測序對陽性質粒PCR產物和68個呈陽性的PCR產物進行切膠回收，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

2結果與分析

2.1轉化植株的Gus表達檢測

通過GUS組織化學定位法，對根癌農桿菌194菌液侵染的苜蓿組培苗葉片進行GUS瞬時表達檢測，轉化植株的GUS瞬時表達呈現出藍色斑點（圖1-B），而對照葉片無藍色斑點（圖1-A），初步證明轉化體系的成功建立。

2.2轉化植株的分子鑒定

本研究利用CTAB法分別提取對照和轉化苜蓿組培苗的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2-A所示，原種與轉化種苜蓿基因組DNA都較完整、濃度大、無脫尾。根癌農桿菌菌株149的pKLP36質粒上含有抗菌肽基因，包括煙草中PR-1b部分編碼區及抗菌肽基因RIL，長約 200 bp；根據圖2-B可知，陽性質粒PCR產物（泳道1）在 100～250 bp 處有條帶，紫花苜蓿原種基因組DNA的PCR產物（泳道2）無目標條帶，而轉化植株基因組DNA的PCR產物有較為清晰的目標條帶（泳道3）。

2.3PCR產物測序

對陽性質粒及PCR呈陽性的產物進行回收后測序，發現測序片段與149質粒對比結果一致，信號值基本在正常范圍內，即150～500，測序片段質量較高，峰圖噪音較低，模板純度較高。由圖3可知，149質粒和13個樣品PR-1b編碼區部分基因以及抗菌肽基因RIL區段均無突變堿基，即測序成功。

3討論

3.1利用GUS瞬時表達檢測轉化體系

Jefferson等首次提出β-葡糖苷酸基因GUS可作為植物遺傳轉化的報告基因之后，在許多國家都得到了廣泛應用，其方法操作簡單，靈敏度高，在基因工程領域得到廣泛地應用。可以用于瞬時表達檢測的報告基因還有綠色熒光蛋白基因（greenfluorescent protein，GFP），但由于有些植物組織中有自發熒光，會影響GFP檢測的準確性，產生弱熒光背景，檢測弱啟動子驅動的GFP活性較難，致使轉基因植物的篩選受到限制[10]。GUS酶有產物的放大作用，可以通過GUS染色來進行檢測，而未轉化植株無GUS活性，因此GUS瞬時表達檢測對遺傳轉化的檢測更加簡便、可靠[11]。因此，GUS是目前轉基因植物中應用最為廣泛的報道基因。關于植物葉片的脫色問題，Bowling等通過30%、75%、95%對擬南芥進行脫色，結果對照呈白色，脫色效果好[12]。因此，本試驗中脫色步驟借鑒此方法，且脫色效果很好，便于結果觀察。

3.2改良的CTAB法提取苜蓿基因組DNA

苜蓿葉片中常含有糖類等物質，使其基因組DNA的提取受限。試驗結果表明：經典的CTAB提取緩沖液法最大的優點是能除去多糖，可用于草本植物基因組DNA提取。本研究在傳統CTAB法的基礎上加入了PVP，可以有效地裂解植物組織細胞，保證核酸完整性。同時，PVP可以與酚類產生絡合物，防止多酚對DNA的污染，還可與多糖結合，除去糖類物質。此外，加入抗氧化劑β-巰基乙醇，可有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。利用改良法提取的苜蓿基因組DNA完整性好、亮度高、濃度較大，可滿足PCR檢測要求。

3.3抗菌肽基因的遺傳轉化前景

抗菌肽分子較小，動物源抗菌肽在植物體內易被蛋白酶快速降解，成為外原抗菌肽在植物體內表達的限制因素。但在作物中表達動物源與植物源的肽是可能的，可通過消除蛋白酶敏感位點來修飾肽，或設計反向類似物，從而實現對病原抗性的提高[13]。Xing等采用來自異源物種中的肽來抵抗植物病原，研究了來自動物源的肽，篩選了肽對植物蛋白酶的敏感性，結果發現，基于反向序列的肽擁有特別強的對植物葉片中蛋白酶的抵抗能，并同時擁有抗菌活性[14]。本研究以根癌農桿菌介導抗菌肽基因Rev4的遺傳轉化并獲得成功，轉化植株作為綠色飼料具有重大的生態和社會效益。

參考文獻：

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