鎘脅迫下超氧陰離子對水稻幼苗根系生長和生長素分布動態變化的影響

鄭欣+劉夏囡+鄭勝男+車軒+周士釗+遲世飛+邢偉+付童童+孫川惠+趙鳳云

摘要：以DR5-GUS轉基因水稻 （以水稻中花11為背景）為試驗材料，分析鎘脅迫下超氧陰離子（O-2· ）介導的根系生長動態變化與生長素重新分布之間的關系。結果發現，在鎘脅迫與非脅迫條件下DDC（SOD抑制劑）處理明顯促進了根系的生長。GUS活性檢測顯示DDC和Cd+DDC處理條件下根系生長的動態變化與生長素濃度和分布的動態變化密切相關。進一步研究顯示，DDC+BFA（蛋白運輸抑制劑）/MG132 /（蛋白降解抑制劑）或Cd+DDC+BFA/MG132處理比DDC或Cd+DDC處理增強了GUS活性。這些結果證實O-2· 介導的生長素重新分布與蛋白轉運/降解有密切關系，O-2· 與生長素信號之間存在交互作用。以上結果表明，適量的O-2· 通過蛋白轉運/降解介導的生長素重新分布是鎘脅迫及非脅迫條件下水稻幼苗根系生長特別是不定根和側根生長所必需的。

關鍵詞：生長素分布；鎘脅迫；水稻根系；超氧陰離子

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0055-04

水稻根系是吸收水分和營養的主要器官，根系的結構受內部遺傳因子和外界環境條件的共同調節[1]。生長素是調節植物根系生長發育的關鍵激素之一，如添加外源生長素促進側根的形成，而使用生長素運輸抑制劑則抑制根的生長[2-3]。研究表明，生長素信號是水稻不定根形成所必需的[4]。高濃度氮對玉米根生長的抑制作用與其降低根系內生長素（IAA）水平有關[5]。各種環境因子和內部信號調節生長素的運輸和極性分布，進而影響植物根系的生長發育[6-7]。如低溫影響擬南芥生長素運輸，從而抑制根系生長[8]；鎘 （Cd）脅迫條件下擬南芥根內生長素的分布與其側根的形成密切關聯[9]；在鋁和銅脅迫植物中根系結構的變化也與生長素重新分布有關[3，10]。近來研究發現，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是調節植物根系生長發育的重要信號分子之一[11-12]。如在非脅迫條件下ROS是調節玉米和水稻根系生長所必需的[13-14]，前期研究也表明 0.1 mmol/L Cd 處理下O-2· 和H2O2參與了水稻根系生長發育的調控[15-16]，但是Cd脅迫下根系生長和生長素分布的動態變化與O-2· 之間的關系還不清楚。Cd是主要的環境污染物，低濃度促進根系生長，高濃度則抑制生長。本試驗進一步研究 0.1 mmol/L Cd 處理條件下根系生長和生長素分布的動態變化與O-2· 之間的關系，旨在為更好地了解Cd脅迫影響植物生長發育的機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與處理

DR5-GUS 轉基因水稻種子（中花 11 為背景，DR5-GUS 報告基因廣泛用于生長素研究）預萌發3 d后分別轉入含0.1 mmol/L Cd（NO3）2、3 mmol/L DDC （SOD 抑制劑） 和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固體MS 培養基上，在培養箱內[光照度200 μmol/（m2·s） 、14 h光照、晝/夜溫度27 ℃/21 ℃和相對濕度60%/80%]培養5～9 d，然后進行數據統計分析。每種處理至少重復3次。

1.2根系生長統計

初生根和不定根長度用尺子測量，側根數量和長度在解剖鏡下統計，每個處理至少用60株幼苗，數據用每株的平均值表示。

1.3O-2· 的測定

上述幼苗處理 9 d后用NBT法[17] 檢測根尖上O-2· 的積累與分布，每種處理至少用 60個根尖，解剖鏡拍照。

1.4根系GUS活性組織化學分析

DR5-GUS轉基因水稻種子預萌發3 d后分別轉入含01 mmol/LCd（NO3）2、3 mmol/L DDC和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固體MS培養基上，在上述條件下培養3～7 d，然后進行GUS活性檢測[18]。為進一步分析 O-2· 與蛋白轉運和降解的關系，DR5-GUS 轉基因水稻種子在MS培養基上萌發生長7 d后轉入Hoagland營養液，分別用50 μmol/L BFA （蛋白轉運抑制劑）或50 μmol/L MG132 （蛋白降解抑制劑） 處理 3 h，再轉入新的Hoagland 營養液分別加入3 mmol/L DDC 或0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC 處理24 h（培養條件同上），取根系進行GUS染色，解剖鏡拍照。每種處理至少用15株。1.5數據統計分析

用SPSS 16.0軟件對不同處理數據進行統計分析，P<005為差異顯著，試驗結果用3次獨立重復的平均值±標準差來表示。

2結果與分析

2.1不同處理對根尖O-2· 積累的影響

與對照相比，Cd、DDC和Cd +DDC處理增加了O-2· 在初生根根尖的積累，而且Cd+DDC處理的根尖O-2· 產生量比單一Cd或DDC處理的多。在每種處理中O-2· 主要集中在分生區和伸長區，不定根中O-2· 的積累與分布變化與初生根的類似（圖1）。

2.2Cd脅迫下O-2· 對初生根生長的影響

Cd、DDC和Cd+DDC處理5～9 d后初生根生長的動態變化存在差異（圖2）。在5～9 d處理期間Cd+DDC比其他處理顯著促進了初生根的生長，與對照比，Cd處理7 d促進生長，而DDC處理9 d時才有明顯的促進作用。

2.3Cd脅迫下O-2· 對不定根生長的影響

在5～9 d處理期間，DDC和Cd+DDC明顯加快了不定根的形成和伸長生長（P<0.05），而Cd 處理7 d時不定根的數量和長度才明顯增加（圖3）。

2.4Cd脅迫下O-2· 對側根生長的影響

Cd+DDC處理5～9 d后側根總數明顯比其他處理的多（P<0.01），而在DDC 處理中這種促進作用發生在處理后9 d（P<0.05，圖4-a）。與對照比，Cd+DDC處理5～9 d后側根總長度明顯增加（P<0.01，圖4-b），而DDC處理7 d時這種促進作用特別顯著（P<0.01）。這些結果表明O-2· 參與了水稻根系生長發育的調節，而且這種促進作用與其水平有關。在Cd、DDC和Cd+DDC處理條件下初生根、不定根、側根生長的動態變化有明顯差異。

2.5Cd脅迫下O-2· 介導的水稻根系生長動態變化與生長素重新分布有關

為進一步了解Cd脅迫下O-2· 介導的根系生長動態變化與生長素時空分布之間的關系，以DR5-GUS轉基因水稻幼苗為材料，測定不同處理3～7 d期間根系GUS活性的變化（圖5）。不同處理3 d時，根內GUS的表達方式類似，GUS染色主要在初生根的前端（圖5-A）。DDC和Cd+DDC處理 5 d 時，GUS的表達方式發生了變化，GUS染色主要集中在不定根和側根，生長素分布的變化與這些根的快速增加和伸長生長密切關聯（圖5-B）。但是對照和Cd處理的根GUS的表達方式變化不明顯，不定根和側根的產生也比較少。Cd處理7 d時，GUS染色在不定根和側根豐富，此時DDC和Cd+DDC處理整個根系GUS活性則比Cd處理的低（圖5-C）。試驗結果表明，生長素分布的動態變化與根系生長的動態變化有密切關系，DDC和Cd+DDC處理加快了生長素的重新分布和不定根與側根的生長；無論在Cd脅迫還是非脅迫條件下O-2· 對根系生長的調節與其調控生長素的重新分布有關。

2.6Cd脅迫下O-2· 介導的生長素分布與蛋白轉運和降解有關

生長素分布是生長素合成和運輸共同作用的結果。OsPIN 是生長素極性運輸蛋白，BFA抑制OsPIN蛋白從內質網向細胞膜的運輸，進而影響生長素的轉運。生長素合成與蛋白代謝有關，MG132抑制蛋白降解，從而介導生長素的分布。DDC+BFA處理24 h，初生根和不定根GUS活性比單一DDC處理的強；同樣，Cd+DDC+BFA處理的GUS活性也比Cd+DDC處理的強（圖6），表明O-2· 調節的生長素重新分布與蛋白轉運有關。DDC+MG132處理的根GUS活性比DDC處理的強，與此類似，Cd+DDC+MG132處理的根GUS活性也比Cd+DDC處理的高（圖6），說明O-2· 介導的生長素重新分布與蛋白降解有密切關系。

3討論與結論

越來越多的研究表明，ROS是調節植物根系生長發育的重要信號分子[12-13]。前期研究顯示，在分子水平上O-2· 影響生長素和細胞周期基因的表達[15]。本研究中不同處理條件下初生根、不定根、側根生長的動態變化與O-2· 水平有密切關系。在Cd脅迫和非脅迫條件下，較高的O-2· 促進不定根和側根的生長發育，特別是在幼苗生長早期（5～7 d）這種促進作用更明顯（圖1至圖5）。這些結果說明 O-2· 在水稻根系生長過程中有重要的調節作用。值得注意的是，在幼苗生長早期適量的O-2· 促進根系的快速生長對植物在脅迫條件下的生存至關重要。研究發現，生長素運輸是水稻不定根形成所必需的[4]，本研究中DDC和Cd+DDC處理5 d時顯著促進了不定根的形成和生長，說明O-2· 在這一過程中可能影響了生長素運輸（圖2、圖5）。生長素分布的動態變化調節植物生長發育的眾多過程。本研究中根系生長的動態變化與生長素分布的動態變化密切關聯，較高水平的O-2· （DDC和Cd+DDC處理）加快了生長素的重新分布，促進了不定根和側根的快速生長（圖5）。生長素的局部濃度是生長素合成和轉運共同作用的結果，與蛋白轉運和代謝有關。本研究中DDC+BFA/MG132和Cd+DDC+BFA/ MG132處理的根中GUS活性明顯高于DDC和Cd+DDC處理的根，這些結果證實O-2· 介導的生長素重新分布與蛋白轉運和降解有密切關系。O-2· 與生長素信號存在交互作用，本試驗條件下O-2· 可能在生長素信號傳導途徑的上游發揮作用，因為O-2· 影響生長素的分布，但不能排除 O-2· 通過其他途徑調節水稻根系的生長和生長素分布。

參考文獻：

[1]Rebouillat J，Dievart A，Verdeil J L，et al. Molecular genetics of rice root development[J]. Rice，2009，2（1）：15-34.

[2]Huang F，Zago M，Abas L，et al. Phosphorylation of conserved PIN motifs directs Arabidopsis PIN1 polarity and auxin transport[J]. Plant Cell，2010，22（4）：1129-1142.

[3]Sun J，Xu Y，Ye S，et al. Arabidopsis ASA1 is important for jasmonate-mediated regulation of auxin biosynthesis and transport during lateral root formation[J]. Plant Cell，2009，21（5）：1495-1511.

[4]Zhao Y，Hu Y，Dai M，et al. The WUSCHEL-related homeobox gene WOX11 is required to activate shoot-borne crown root development in rice[J]. Plant Cell，2009，21（3）：736-748.

[5]Tian Q，Chen F，Liu J，et al. Inhibition of maize root growth by high nitrate supply is correlated with reduced IAA levels in roots[J]. Journal of Plant Physiology，2008，165（9）：942-951.

[6]Wang J，Hu H，Wang G，et al. Expression of PIN genes in rice （Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant，2009，2（4）：823-831.

[7]Friml J. Subcellular trafficking of PIN auxin efflux carriers in auxin transport[J]. European Journal of Cell Biology，2010，89（2/3）：231-235.

[8]Shibasaki K，Uemura M，Tsurumi S，et al. Auxin response in Arabidopsis under cold stress：underlying molecular mechanisms[J]. The Plant Cell，2009，21（12）：3823-3838.

[9]Potters G，Pasternak T，Guisez Y，et al. Stress-induced morphogenic responses：growing out of trouble？[J]. Trends in Plant Science，2007，12（3）：98-105.

[10]Lequeux H，Hermans C，Lutts S，et al. Response to copper excess in Arabidopsis thaliana：impact on the root system architecture，hormone distribution，lignin accumulation and mineral profile[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（8）：673-682.

[11]Pasternak T，Rudas V，Potters G，et al. Morphogenic effects of abiotic stress：reorientation of growth in Arabidopsis thaliana seedlings[J]. Environmental and Experimental Botany，2005，53（3）：299-314.

[12]De Tullio M，Jiang K，Feldman L. Redox regulation of root apical meristem organization：connecting root development to its environment[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（5）：328-336.

[13]Liszkay A，van der Zalm E，Schopfer P. Production of reactive oxygen intermediates （O-2· ，H2O2，and ·OH） by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth[J]. Plant Physiology，2004，136（2）：3114-3123；discussion 3001.

[14]Kim S G，Kim S T，Kang S Y，et al. Proteomic analysis of reactive oxygen species （ROS）-related proteins in rice roots[J]. Plant Cell Reports，2008，27（2）：363-375.

[15]Zhao F Y，Hu F，Han M M，et al. Superoxide radical and auxin are implicated in redistribution of root growth and the expression of auxin and cell-cycle genes in cadmium-stressed rice[J]. Russian Journal of Plant Physiology，2011，58（5）：851-863.

[16]Zhao F Y，Han M M，Zhang S Y，et al. Hydrogen peroxide-mediated growth of the root system occurs via auxin signaling modification and variations in the expression of cell-cycle genes in rice seedlings exposed to cadmium stress[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（12）：991-1006.

[17]Jabs T，Dietrich R，Dangl J. Initiation of runaway cell death in an Arabidopsis mutant by extracellular superoxide[J]. Science （New York，N.Y.），1996，273（5283）：1853-1856.

[18]Petersson S V，Johansson A I，Kowalczyk M，et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis[J]. The Plant Cell，2009，21（6）：1659-1668.