辣椒疫霉菌SSR—PCR反應體系的建立及優化

陶麗婷+楊世鵬+王麗慧+李屹+李莉

摘要：為快速有效地確定辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系，采用正交優化設計方法，對影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系的4個主要因素（模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶）在4個水平上進行優化。結果表明，不同因素下各水平濃度對SSR-PCR的反應結果均有顯著性影響，最佳反應體系（20 μL）為：1.0 ng模板DNA，0.8 μmol/L引物，0.5 μmol/L dNTPs，1.0 U Taq酶。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，58.4 ℃退火30 s，36個循環，72 ℃延伸 2 min，最佳循環數為36。利用該體系對12份辣椒疫霉菌進行驗證，證明該體系穩定可靠，本試驗為辣椒疫霉菌遺傳多樣性分析研究及分子育種奠定了理論基礎。

關鍵詞：辣椒疫霉菌；SSR-PCR；正交設計；體系優化

中圖分類號： S436.418文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0080-04

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）是引起辣椒疫病的霜霉屬真菌，危害作物根、莖、葉，卵孢子可在土壤中越冬。由于疫病是土傳病害，傳播速度快、途徑廣，給辣椒生產帶來巨大的經濟損失[1]。目前，種植抗病品種是防治辣椒疫病的有效方法之一，然而，辣椒疫霉菌具有很高的變異性[2]，基于SSR標記具有位點多態性高的特點，可以揭示這些變異并發現不同種間的多態性[3]。因此，對辣椒疫霉菌遺傳多樣性的深入研究對辣椒抗病育種及群體結構分析具有重要意義。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）又稱微衛星DNA（microsatellite DNA）是以1～6個核苷酸多次串聯重復的DNA序列[4]，具有數量豐富、多態性高、對DNA質量要求不高且重復性好、可靠性高等特點[5]。SSR位點的多態性對基因及基因組的遺傳變異具有重要作用，可用于研究真菌種群的遺傳結構多樣性[6]，但相關疫霉菌的報道較少[7]。藺宇等通過對大豆疫霉菌EST開發新的SSR標記，來研究大豆疫霉菌的遺傳變異[8]。孫文秀等對7個不同區域的辣椒疫霉菌進行RAPD分析，探索了不同區域辣椒疫霉菌的遺傳分化關系[9]。姚國勝等用SSR對馬鈴薯致病疫霉群體結構進行分析并完善了其分子標記體系[10]。

本研究對Taq酶、模板DNA、dNTP、引物等4個因素，在4個不同濃度水平下進行正交試驗設計，進行擴增體系的優化，并對退火溫度進行優化， 以期確定辣椒疫霉菌SSR-PCR反應的最優體系，為后續群體遺傳多樣性分析等奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本試驗所用材料為青海省農林科學院園藝研究所采集的來自青海省海東市樂都區、循化縣、大通縣、互助縣、貴德縣等5個地區的12株辣椒疫霉菌。菌株信息如表1所示。

試驗所用Taq酶、dNTPs、DNA Marker（D2000）、Mg2+、10×PCR buffer均購自天根生化科技（北京）有限公司。SSR引物根據GeneBank所公布的辣椒疫霉菌全序列基因，利用引物設計軟件Primer 5設計而成，引物由北京華大基因有限公司合成。

核酸檢測儀（2000C，購自Thermo）；PCR儀（Eppendorf Mastercycler pro，購自上海研域儀器設備有限公司）；電泳儀（DYY-6C型，購自北京市六一儀器廠）；凝膠成像儀（ImageQuant300/350/RTECL，購自Bio-RAD）。

1.2基因組DNA提取與檢測

采用生工UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取辣椒疫霉菌基因組DNA。用核酸檢測儀確定DNA濃度與純度，并將樣品DNA稀釋到所需濃度，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，并在凝膠成像儀上分析與拍照，最后于-80 ℃保存。

1.3PCR反應體系正交試驗

以采集自青海省海東市樂都區的辣椒疫霉菌（LL04）為試驗材料，BJP05號引物（5′-3′：GACTCGGACTCGGACGAC，3′-5′：CTCCTGCTCATCTTTCAGGC）為試驗引物，SSR-PCR反應體系的4個因素分別為模板DNA、dNTPs、引物、Taq酶的濃度，采用L16（44）正交試驗設計進行4因素4水平篩選分析，方案如表2、表3所示。設試驗總體系為20 μL，按照表2中要求加入，另加4 μL 10×PCR buffer、2 μL Mg2+，用ddH2O補足 20 μL。SSR-PCR擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，58.4 ℃退火30 s，36個循環，72 ℃延伸 2 min，4 ℃保存。所得PCR擴增產物加5 μL 6×Loading buffer，充分混勻后，取10 μL在1%瓊脂糖凝膠上120 V恒壓下電泳30 min，電泳結束后在凝膠成像系統上觀測拍照。

1.4正交試驗數據分析

本試驗數據統計參照申潔等的方法[11]，統計可識別條帶，同時參考條帶明亮程度及背景清晰度，進行數據分析。數據采用極差、方差和多重比較方法分析各個處理結果，結果如表4所示。

1.5退火溫度優化

PCR反應體系中，每對引物都有其最適宜的退火溫度。對同一模板、引物，設退火溫度梯度進行PCR擴增反應，以引物的參考退火溫度±4 ℃上下浮動[12]，以期獲得該反應體系下最佳退火溫度。依據上述試驗的最優反應體系對退火溫度進行優化。采用梯度PCR模式，自動設定溫度為54.4～61.4 ℃，生成溫度梯度54.4、55.6、56.4、57.2、58.4、59.0、60.5、61.2 ℃。其他反應程序與PCR正交試驗設計的擴增程序相同。

1.6擴增體系穩定性驗證

利用優化的體系，以BJP05號引物隨機選取12份辣椒疫霉菌DNA模板分別進行SSR-PCR擴增，進行辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系的穩定性檢測。

2結果與分析

2.1基因組DNA提取與檢測

本試驗利用生工真菌基因組DNA抽提試劑盒提取12份辣椒疫霉菌模板DNA，用核酸檢測儀檢測模板DNA濃度及純度，其D260 nm/D280 nm值在1.80～1.92之間，DNA濃度平均為320 ng/μL，加ddH2O稀釋至所需濃度，-80 ℃保存。

2.2SSR-PCR擴增結果

利用正交優化設計L16（44），PCR擴增產物電泳結果如圖1所示，16個處理結果均有條帶出現。從圖1可以看出，4個因素在不同水平處理下其擴增結果存在明顯差異。處理2、6、9、10、11、13、15的擴增條帶數多且清晰，其中9、10、11處理主條帶較明顯，因此可認為這3個組合——9（A3B1C3D4）、10（A3B2C4D3）、11（A3B3C1D2）是16個正交試驗處理中較適合辣椒疫霉菌SSR-PCR擴增的組合。2.3正交試驗數據分析

組合9、10、11是16個正交試驗處理中較優的組合，根據所得試驗數據對各因素進行數據分析，以確定最佳組合。極差越大，離散程度越大，也說明該因素對試驗結果影響最大[13-14]。由表4可知，影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系的4個因子中，模板DNA濃度影響最大，其次是引物濃度，再次是Taq酶濃度，影響最小的是dNTPs濃度。由此判斷出，SSR-PCR擴增結果特異性條帶多且亮的3個組合中最優的反應體系是組合11（A3B3C1D2）。

為驗證以上結果，對表4中各組合下擴增片段數據進行方差分析，結果如表5所示，4因素F值的大小順序為模板DNA>引物>Taq酶>dNTPs，說明模板DNA濃度對辣椒疫霉菌SSR-PCR擴增結果影響最大，其次是引物濃度和Taq酶濃度，dNTPs濃度對擴增反應結果影響最小。其中，模板DNA、引物、Taq酶各濃度水平對PCR擴增結果均有顯著性差異，且模板DNA各水平對擴增結果具有極顯著性差異。方差分析結果與極差分析結果一致，則證明正交優化設計表中第11組處理是辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系的最優處理，即影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應體系的4因素最佳濃度水平分別為1.0 ng模板DNA、0.8 μmol/L引物、0.5 μmol/L dNTPs、1.0 U Taq酶。

2.4PCR退火溫度篩選

PCR反應中，退火溫度可能直接影響模板與引物的特異性結合。如圖2所示，8個退火溫度下均可擴增出特異性條帶，在退火溫度低時，非特異性條帶增多，且條帶模糊不清晰，在退火溫度高時，條帶較暗。第1、2、3退火溫度處理條帶擴增彌散嚴重，背景較深，出現非特異性條帶且主帶亮度較弱；隨著退火溫度的升高，第6、7、8退火溫度處理條帶彌散減少，擴增不穩定且主帶缺失；當退火溫度為57.2～58.4 ℃時， 擴增條帶清晰，重復性好且主條帶亮，但以58.4 ℃時擴增效果最佳。因此確定該引物的最佳退火溫度為58.4 ℃。

2.5SSR-PCR最佳反應體系穩定性檢測結果

采用上述最佳反應體系結果，用BJP05號引物，對來自青海省海東市樂都區、互助縣、大通縣、循化縣、貴德縣的12份辣椒疫霉菌DNA進行SSR擴增。結果如圖3所示，引物對每份DNA樣品均擴增出清晰的、多態性高且重復性好的目的條帶，說明該體系穩定性較好，適用于辣椒疫霉菌的SSR反應。

3討論

由于SSR標記易受到反應體系和擴增程序的影響，且各因素間又存在互作效應[15]，因此確定辣椒疫霉菌SSR-PCR最佳反應體系能夠迅速獲得試驗結果，為辣椒疫霉菌遺傳多樣性研究的順利進行節省時間與成本[16]。本試驗采用 L16（44） 正交試驗設計，確立最佳組合，通過方差分析確定各個因素在4個濃度水平下對SSR-PCR反應影響的大小。

在PCR反應標準體系中，影響PCR結果的5個因素為Taq酶、Mg2+、DNA、dNTPs、引物。Mg2+是影響PCR結果的重要變量之一，高濃度的Mg2+，使非特異性條帶增多，濃度過低，影響酶活性。在前人研究中，Mg2+的用量浮動不大[17]，其濃度在1.5～2.0 μmol/L之間浮動，本試驗在20 μL體系中加2 μL Mg2+，使其終濃度保持在分子克隆標準體系的較低水平，因此，本試驗未對Mg2+濃度作相關分析。dNTPs是PCR反應的底物[18]，高濃度的dNTPs會與酶競爭游離的Mg2+，降低其活性，引起錯配，低濃度則會影響擴增效率。Taq酶是對Mg2+依賴的酶，濃度過高產生非特異性擴增，濃度過低會引起反應靈敏度差，使條帶彌散。DNA是PCR反應的基礎，前人研究認為DNA的波動范圍較廣，其濃度在 1.0～6.0 ng/μL之間對反應影響不大[19]。DNA濃度過高使模板之間配對概率增加，相對減少了引物與模板的配對機會，降低引發效率，易產生非特異性擴增[20]。本試驗結果表明模板DNA對PCR反應影響最大，引物、Taq酶次之，dNTP濃度影響最小。退火溫度決定PCR特異性和產量，溫度過高引物不能與模板牢固結合，過低則容易使引物和模板錯配，非特異性產物增加。可通過設置一系列梯度，以確定某些反應的特定退火溫度，本試驗設置8個梯度，篩選出最佳退火溫度為58.4 ℃。

綜上所述，不同物種對SSR-PCR擴增體系影響各不相同，因此，采用SSR-PCR的方法研究遺傳多樣性之前對反應體系的優化是必不可少的，不但減少試驗工作量節省成本，而且將增加對遺傳多樣性研究的多態性，提供試驗的可重復性。

參考文獻：

[1]鄭小波. 疫霉菌及其研究技術[M]. 北京：中國農業出版社，1997.

[2]Kirk P M，Cannon P F，Minter D W，et al. Ainsworth & bisbys dictionary of the fungi[M]. 10th ed. Wallingford：CAB International，2008.

[3]梁玉琴，李芳東，傅建敏，等. 正交設計優化柿屬植物SSR-PCR反應體系[J]. 經濟林研究，2011，29（4）：17-22.

[4]謝晶晶，姜華，毛雪琴，等. 利用SSR技術研究浙江省稻瘟病菌群體的遺傳多樣性[J]. 浙江農業學報，2015，27（10）：1781-1788.

[5]鄭成木. 植物分子標記原理與方法[M]. 長沙：湖南科學技術出版社，2003.

[6]Litt M，Luty J A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene[J]. American Journal of Human Genetics，1989，44（3）：397-401.

[7]Wu K S，Tanksley S D. Abundance，polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice[J]. Molecular Genetics and Genomics，1993，241（1）：225-235.

[8]藺宇，朱振東，王曉鳴，等. 大豆疫霉菌鑒定和檢測的特異性SSR標記建立[C]//中國植物病理學會. 中國植物病理學會2006年學術年會論文集. 北京：中國農業科學技術出版社，2006.

[9]孫文秀，張修國，賈永健，等. 不同地區辣椒疫霉菌遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 植物病理學報，2005，35（4）：340-344.

[10]姚國勝，王俊山，楊英茹，等. 河北省和黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型分析[J]. 科技導報，2008，26（5）：35-39.

[11]申潔，侯思宇，孫朝霞，等. 正交優化棗樹ISSR-PCR反應體系的研究[J]. 華北農學報，2010，25（2）：116-120.

[12]李亞利，陳書霞，孟煥文，等. 利用正交設計優化黃瓜的SSR-PCR反應體系[J]. 西北農業學報，2008，17（3）：280-284.

[13]郭海林，王志勇，薛丹丹，等. 結縷草屬植物SSR反應體系的優化及其應用[J]. 植物遺傳資源學報，2008，9（2）：138-143.

[14]葉青雷，王玲玲，藏楠，等. 槲樹DNA SSR-PCR反應體系的正交優化[J]. 蠶業科學，2008，34（2）：307-311.

[15]蘇輝，李志剛，宋書宏. 正交設計優化大豆SSR-PCR反應體系及引物篩選[J]. 華北農學報，2009，24（2）：99-102.

[16]王歡歡，姜晶，王慧，等. 正交設計優化番茄基因組DNA SSR-PCR反應體系[J]. 江蘇農業科學，2009（2）：48-50.

[17]張崎峰，靳學慧，張亞玲，等. 正交設計優化稻瘟病菌SSR-PCR反應體系[J]. 安徽農業科學，2009，37（22）：10426-10428.

[18]楊傳平，王艷敏，魏志剛. 利用正交設計優化白樺的SSR-PCR反應體系[J]. 東北林業大學學報，2006，34（6）：1-3.

[19]龍萄，黃春瓊，劉國道. 正交設計優化狗牙根SSR-PCR反應體系[J]. 基因組學與應用生物學，2016，35（1）：198-205.

[20]張卿哲，孟金貴，張應華，等. 用正交設計法優化辣椒ISSR-PCR反應體系[J]. 西南農業學報，2011，24（3）：1034-1038.