遼星系列水稻品種稻瘟病抗性基因鑒定與抗性分析

潘爭艷+邱福林+呂桂蘭+馬秀芳+王艷華+高虹+李小婉+李睿

摘要：利用采自遼寧省4個稻區(qū)的20株稻瘟病菌對遼星系列水稻品種進(jìn)行抗病性鑒定，苗期發(fā)病級數(shù)為0～5級，穗期發(fā)病級數(shù)為1～7級。苗期和穗期抗性頻率均大于等于85%的有2個品種，抗性頻率均小于等于35%的有4個品種。利用已開發(fā)的10個抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記對21份遼星系列水稻品種進(jìn)行抗性基因分子檢測，21份遼星系列品種含有的抗性基因數(shù)量在2～5個之間。這些品種中均不含Pi9、Pi40基因，而Pik-h、Pi1和Pib基因較廣泛地分布在遼星系列水稻品種中。隨著抗性基因位點(diǎn)數(shù)量的增多，品種表現(xiàn)出中等抗病性。

關(guān)鍵詞：稻瘟病；遼星水稻品種；抗性基因

中圖分類號：S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0087-04

由子囊菌Magnaporthe grisea（Hebert） Barr引起的稻瘟病廣泛發(fā)生在世界各稻區(qū)，是最具毀滅性的水稻病害之一，嚴(yán)重阻礙水稻高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)。抗性基因的利用是控制稻瘟病的關(guān)鍵措施之一。自20世紀(jì)60年代日本開展水稻抗稻瘟病基因的遺傳研究以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)約100個抗性基因[1]。這些基因成簇地分布于除水稻第3染色體外的所有染色體上，其中27個稻瘟病抗性基因已被克隆。

Piz和Pik是水稻中目前報道含有廣譜高抗稻瘟病最多的2個位點(diǎn)[2]，抗瘟基因Pi9是國際上第一個被克隆的廣譜抗病基因，對來自世界各地的稻瘟病生理小種表現(xiàn)出極高的廣譜抗性[3-5]。到目前為止，至少有9個稻瘟病抗性基因（Pi2、Piz、Piz-t、Pi40、Pigm、Pi9、Pi26、Pi50、Pi2-2）已經(jīng)被定位在水稻第6染色體短臂端的Pi2/9基因簇內(nèi)，其中Pi9、Pi2以及Piz-t已經(jīng)被成功克隆[4，6]。Pi1、Pik-h、Pik-m、Pik-p等是等位基因，其中Pik-h基因在稻種資源中存在較多[7-8]，且對印度不同地區(qū)的稻瘟病菌株表現(xiàn)出很高的抗性。抗性基因Pita及Pib在水稻種質(zhì)資源中出現(xiàn)頻率也較高，且Pita基因極少在高感品種中出現(xiàn)[9]。

本研究選取與抗性基因Pita、Pib、Pik-h、Pi1、Pik-m、Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm和Pi40緊密連鎖的標(biāo)記對遼星系列水稻品種進(jìn)行抗性基因分析，結(jié)合苗期和穗期接種鑒定，明確這些品種攜帶的抗性基因，以拓寬抗病遺傳基礎(chǔ)，提高水稻品種抗性。

1材料與方法

1.1供試材料

21份遼星系列品種，由遼寧省水稻研究所培育審定。

1.2DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取總DNA。以總DNA為模板，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為2 μL DNA模板，上下游引物各2 μL，10 μL Taq酶，加ddH2O至20 μL，引物序列如表1所示。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火，72 ℃延伸， 35個循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠（EB）的 1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳 1.5 h， 在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。抗性基因Pi9的檢測在3%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行。

1.3供試菌株

20份稻瘟病菌菌株分別來自遼寧省4個稻區(qū)，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，詳細(xì)信息如表2所示。

1.4遼星系列水稻品種苗期抗病性鑒定

水稻浸種、催芽后播種于裝有肥沃田土的塑料育苗盤內(nèi)，均設(shè)麗江新團(tuán)黑谷為感病對照，3次重復(fù)。待稻苗長至3葉1心期時進(jìn)行噴霧接種，接種7 d后（感病對照發(fā)病充分）調(diào)查發(fā)病情況。按農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻稻瘟病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》0～9級制對供試品種苗期發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查并記載病情（記錄最高病級）[21]。

1.5遼星系列水稻品種田間穗期抗病性鑒定

稻穗破口期對21份遼星系列水稻品種采用注射法進(jìn)行接種（以麗江新團(tuán)黑谷為感病對照），每個品種接種20株，每株接種3穗。蠟熟期按農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻稻瘟病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》調(diào)查并記載發(fā)病情況（0～3級為抗病）[21]。

2結(jié)果與分析

2.1遼星系列水稻品種抗病性表現(xiàn)

利用采自遼寧省4個稻區(qū)的20株稻瘟病菌對遼星系列水稻品種進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果如表3所示，苗期發(fā)病級數(shù)為0～5級，穗期發(fā)病級數(shù)為1～7級。苗期和穗期抗性頻率大于等于85%的有遼星2號、遼星6號和遼星16號，其苗期和穗期發(fā)病最高級數(shù)都在1級及以下。其中供試的 20株菌株僅有2株可以侵染遼星6號。抗性頻率小于等于35%的有遼星1號、遼星7號、遼星12號和遼星18號。除遼星7號外，其余3個品種穗期最高發(fā)病級數(shù)都達(dá)到7級。20株稻瘟病菌菌株均可在穗期侵染遼星12號。

2.221個品種抗病基因分型

利用已開發(fā)的10個抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記對21份遼星系列水稻品種進(jìn)行抗性基因分子檢測，結(jié)果如表4所示，21份材料中均不含Pi9、Pi40基因，而Pik-h、Pi1、Pib基因較廣泛地分布在遼星系列水稻品種中。攜帶Pik-h、Pi1、Pib、Pita、Pik-m、Pi2、Piz-t、Pigm抗性基因的遼星系列品種分別為16份（76.2%）、13份（61.9%）、13份（61.9%）、10份（47.6%）、10份（47.6%）、4份（19.0%）、3份（14.2%）、4份（19.0%）。21份遼星系列品種中沒有品種含有全部的10個抗性基因，也沒有品種不含有任何抗性基因，含有的抗性基因數(shù)量在2～5個之間，其中遼星7號、遼星12號和遼星18號僅檢測到2個抗性基因，遼星14號和遼星17號檢測到5個抗性基因。

2.3遼星系列水稻品種抗病反應(yīng)與抗性基因關(guān)系

苗期和穗期抗譜大于等于85%的遼星2號、遼星6號和遼星16號等3個品種中，遼星2號攜帶3個抗性基因，分別為Pita、Pi1、Pik-m；遼星6號攜帶4個抗性基因，分別為Pita、Pib、Pik-h、Pi1；遼星16號攜帶4個抗性基因，分別為Pita、Pik-h、Pi1、Pi2。這3個品種中均含有Pita、Pi1抗性基因。抗譜小于等于35%的遼星1號、遼星7號、遼星12號和遼星18號等4個品種含有2～4個抗性基因，其中遼星1號攜帶4個抗性基因，其余3個品種均僅攜帶2個抗性基因。這4個品種均不含Pita、Pi2基因。總體上，遼星系列品種隨著品種含有的抗性基因位點(diǎn)數(shù)量的增多，對稻瘟病的抗性表現(xiàn)中等至高等抗病性。

3討論

要針對性地改良品種抗性，在時間和空間上合理布局抗病良種，首先需要了解品種本身的抗性基因型。遼星系列品種是遼寧省水稻研究所經(jīng)過幾代人培育出來的品種，具有一定的代表性。遼寧省地理環(huán)境復(fù)雜，本試驗(yàn)選擇的20株稻瘟病菌菌株分屬于遼寧省4個稻區(qū)，對21份遼星系列水稻品種進(jìn)行苗期和穗期接種鑒定，抗性頻率均大于等于85%的有3個品種，分別是遼星2號、遼星6號和遼星16號，表明遼星系列水稻品種蘊(yùn)含優(yōu)良的抗源材料。

21份遼星系列品種含有的抗性基因數(shù)量在2～5個之間。已有研究表明稻種資源中存在Pik-h基因材料較多，21份遼星系列品種中有16個品種攜帶Pik-h基因。Pita存在遼星系列品種中抗、高抗品種中，不存在高感品種中；Pi9和Pi40基因分離自野生稻，在遼星系列品種中沒有檢測到。結(jié)合病原菌接種單基因發(fā)病情況，僅1株可以引起單基因系Pita 致病，有3株病原菌可以引起單基因系Pi9致病，在以后的抗病育種中，可以考慮適當(dāng)引入Pita、Pi9、Pi40等基因。

隨著抗性基因位點(diǎn)數(shù)量的增多，品種抗病性表現(xiàn)出中等抗病性。這與張羽等的研究結(jié)果，隨著抗性基因位點(diǎn)數(shù)目的增多，品種的抗病性呈上升趨勢[22]不一致，可能遼星系列品種中存在其他未檢測的抗性基因，或者這些品種中的抗病性是由多個基因相互制約而成。

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