不同生長階段椰樹葉片對椰心葉甲中腸消化酶活性的影響

李藝瓊+姚羽芯+彭正強+呂寶乾+金啟安+溫海波

摘要：為探明椰心葉甲對椰樹不同生長階段葉片選擇性取食的營養生理機制，研究椰樹心葉、半展葉、展葉的營養成分含量差異以及這3個生長階段葉片對椰心葉甲5齡幼蟲中腸6種消化酶活性的影響。結果表明，椰樹葉片營養成分中，蔗糖、淀粉、脂肪含量均為心葉中最低，展葉中最高，粗纖維含量無顯著差異；椰心葉甲幼蟲在取食不同生長階段的椰樹葉片后，中腸消化酶活性有顯著變化，取食椰樹半展葉、展葉的椰心葉甲5齡幼蟲中腸蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶比取食心葉的椰心葉甲5齡幼蟲均有顯著下降，而無論是取食椰樹心葉、半展葉還是展葉，椰心葉甲5齡幼蟲中腸消化酶均為淀粉酶活性最高，蛋白酶次之。

關鍵詞：椰心葉甲；寄主植物；營養物質；消化酶活性

中圖分類號： S433.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0094-04

椰心葉甲[Brontispa longissima （Gestro）]屬鞘翅目（Coleoptera）鐵甲科（Hispidae），是棕櫚科植物的重要害蟲，自2002年入侵海南省后，椰心葉甲迅速擴散繁殖，現已擴散蔓延到海南全省，廣東、廣西、云南、福建等部分地區也有發生危害[1]。椰心葉甲在我國南方的入侵和暴發嚴重影響了當地的經濟和生態環境[1]。在野外，椰心葉甲成蟲和幼蟲均取食椰樹等寄主未展開的心葉表皮組織，形成與葉脈平行的狹長褐色條斑，心葉展開后呈大型褐色壞死條斑，嚴重時整株死亡[2]。

植食性昆蟲通過取食寄主植物來獲取生長發育所需的糖類、蛋白質和脂肪等營養物質。糖類是昆蟲重要的植物源營養，同時也是重要的能量來源，特別是在繁殖和飛行方面[3]。蛋白質是植食性昆蟲必需的植物源營養，昆蟲可以通過取食含有蛋白質的植物來獲取氨基酸，而這些氨基酸含有多種用途，如直接用于昆蟲蛋白質的生物合成，特別是信息素和神經肽[4]。寄主植物的數量和質量是決定昆蟲生長發育和繁殖的最重要因素，每種寄主都含有不同種類和含量的營養物質[5]。Zhang等的研究表明，寄主植物營養成分含量的不同，可顯著影響昆蟲的生長發育和繁殖[3，6-8]。

昆蟲中腸消化酶主要包括α-淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶及脂肪酶[9]，用來消化分解通過取食攝入的糖類、纖維素、蛋白質和脂肪。昆蟲消化酶在將通過取食攝入的混合食物原料轉變成為小分子物質并提供能量及代謝物中扮演著重要的角色[10]。同時，不同寄主植物含有不同含量的營養元素、不同的抑制因子以及次生代謝物質，因此可以影響昆蟲的消化酶活性，寄主植物的任何變化都會影響這些消化酶的活性及隨后的生理過程[11]。Mardani-Talaee等研究表明，在取食不同寄主植物時，昆蟲消化酶活性會發生相應的改變[5，11-15]。

當研究昆蟲防治方法時，對目標昆蟲的生理學、中腸生理生化反應過程及中腸微生物的深入了解是至關重要的[16]。故本研究從椰樹不同生長階段葉片營養成分含量差異及對中腸消化酶活性的影響出發，探究其寄主選擇的營養代謝機制，這對闡明椰心葉甲取食選擇性及開發利用酶抑制劑防治椰心葉甲等都具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蟲源供試椰心葉甲為中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所昆蟲飼養室在溫度（26±2）℃、濕度（75±5）%條件下，分別以椰樹心葉、半展葉、展葉飼養至5齡的椰心葉甲健康蟲體。

1.1.2供試寄主植物試驗中采用的植物材料為椰樹的心葉、半展葉、展葉，均采自海南省儋州市長坡鎮椰樹林場，試驗前將采自田間的葉片清洗干凈，晾干后備用。

1.2試驗方法

1.2.1不同生長階段椰樹葉片營養成分含量測定測定心葉、半展開葉、完全展開葉的營養成分含量。蔗糖含量測定采用紫外分光光度法[17]；淀粉含量測定采用紫外分光光度法[17]；粗纖維含量測定采用酸堿劑洗滌法[18]；粗蛋白含量測定采用微量凱氏定氮法[19]；粗脂肪含量測定采用索氏提取法[20]。

1.2.2酶液制備分別采集心葉、半展開葉和完全展開葉飼養的個體大小一致的椰心葉甲5齡幼蟲各10頭，在冰浴上解剖取其中腸，置于勻漿器中加入1 mL預先冰浴的蒸餾水在冰浴中勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，置于 -20 ℃ 冰箱冷藏，作為酶源備用。樣品蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[21]，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白。

1.2.3淀粉酶活性測定淀粉酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[22]，并略加改進。在5 mL試管中分別加入 320 μL 檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH值=5）、150 μL酶液以及250 μL 0.1%淀粉溶液，混勻后于35 ℃水浴中溫育 30 min，溫育結束后加入1 mL二硝基水楊酸（DNS）試劑以停止反應。最后將反應混合物沸水浴10 min，冷卻后于540 nm處讀取D540 nm。采用麥芽糖標準曲線（y=5.032 6x-0.019 9，r=0.998 1；y為 540 nm 處吸光度；x為麥芽糖濃度，mg/mL）計算樣品反應后麥芽糖含量。淀粉酶活性以單位時間、單位質量樣品蛋白中麥芽糖的物質的量[μmol/（mg·min）]表示。空白對照以緩沖液代替酶液。

1.2.4蔗糖酶活性測定蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[23]，并略加改進。除反應底物為1%蔗糖，緩沖液為磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值=6.5），反應時間為 60 min，葡萄糖標準曲線（y=6.021 6x+0.008 3，r=0.999 1）外，其余步驟與“1.2.3”節中相同。

1.2.5纖維素酶活性測定纖維素酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[24]，并略加改進。除反應底物為2%羧甲基纖維素鈉（CMC），緩沖液為檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH值=6.0），反應時間為60 min，反應溫度為50 ℃，葡萄糖標準曲線（y=10.293 0x-0.027 5，r= 0.998 0）外，其余步驟與“123”節中相同。