不同生長階段椰樹葉片對椰心葉甲中腸消化酶活性的影響

李藝瓊+姚羽芯+彭正強(qiáng)+呂寶乾+金啟安+溫海波

摘要：為探明椰心葉甲對椰樹不同生長階段葉片選擇性取食的營養(yǎng)生理機(jī)制，研究椰樹心葉、半展葉、展葉的營養(yǎng)成分含量差異以及這3個生長階段葉片對椰心葉甲5齡幼蟲中腸6種消化酶活性的影響。結(jié)果表明，椰樹葉片營養(yǎng)成分中，蔗糖、淀粉、脂肪含量均為心葉中最低，展葉中最高，粗纖維含量無顯著差異；椰心葉甲幼蟲在取食不同生長階段的椰樹葉片后，中腸消化酶活性有顯著變化，取食椰樹半展葉、展葉的椰心葉甲5齡幼蟲中腸蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶比取食心葉的椰心葉甲5齡幼蟲均有顯著下降，而無論是取食椰樹心葉、半展葉還是展葉，椰心葉甲5齡幼蟲中腸消化酶均為淀粉酶活性最高，蛋白酶次之。

關(guān)鍵詞：椰心葉甲；寄主植物；營養(yǎng)物質(zhì)；消化酶活性

中圖分類號： S433.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0094-04

椰心葉甲[Brontispa longissima （Gestro）]屬鞘翅目（Coleoptera）鐵甲科（Hispidae），是棕櫚科植物的重要害蟲，自2002年入侵海南省后，椰心葉甲迅速擴(kuò)散繁殖，現(xiàn)已擴(kuò)散蔓延到海南全省，廣東、廣西、云南、福建等部分地區(qū)也有發(fā)生危害[1]。椰心葉甲在我國南方的入侵和暴發(fā)嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境[1]。在野外，椰心葉甲成蟲和幼蟲均取食椰樹等寄主未展開的心葉表皮組織，形成與葉脈平行的狹長褐色條斑，心葉展開后呈大型褐色壞死條斑，嚴(yán)重時整株死亡[2]。

植食性昆蟲通過取食寄主植物來獲取生長發(fā)育所需的糖類、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)。糖類是昆蟲重要的植物源營養(yǎng)，同時也是重要的能量來源，特別是在繁殖和飛行方面[3]。蛋白質(zhì)是植食性昆蟲必需的植物源營養(yǎng)，昆蟲可以通過取食含有蛋白質(zhì)的植物來獲取氨基酸，而這些氨基酸含有多種用途，如直接用于昆蟲蛋白質(zhì)的生物合成，特別是信息素和神經(jīng)肽[4]。寄主植物的數(shù)量和質(zhì)量是決定昆蟲生長發(fā)育和繁殖的最重要因素，每種寄主都含有不同種類和含量的營養(yǎng)物質(zhì)[5]。Zhang等的研究表明，寄主植物營養(yǎng)成分含量的不同，可顯著影響昆蟲的生長發(fā)育和繁殖[3，6-8]。

昆蟲中腸消化酶主要包括α-淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶及脂肪酶[9]，用來消化分解通過取食攝入的糖類、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪。昆蟲消化酶在將通過取食攝入的混合食物原料轉(zhuǎn)變成為小分子物質(zhì)并提供能量及代謝物中扮演著重要的角色[10]。同時，不同寄主植物含有不同含量的營養(yǎng)元素、不同的抑制因子以及次生代謝物質(zhì)，因此可以影響昆蟲的消化酶活性，寄主植物的任何變化都會影響這些消化酶的活性及隨后的生理過程[11]。Mardani-Talaee等研究表明，在取食不同寄主植物時，昆蟲消化酶活性會發(fā)生相應(yīng)的改變[5，11-15]。

當(dāng)研究昆蟲防治方法時，對目標(biāo)昆蟲的生理學(xué)、中腸生理生化反應(yīng)過程及中腸微生物的深入了解是至關(guān)重要的[16]。故本研究從椰樹不同生長階段葉片營養(yǎng)成分含量差異及對中腸消化酶活性的影響出發(fā)，探究其寄主選擇的營養(yǎng)代謝機(jī)制，這對闡明椰心葉甲取食選擇性及開發(fā)利用酶抑制劑防治椰心葉甲等都具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蟲源供試椰心葉甲為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所昆蟲飼養(yǎng)室在溫度（26±2）℃、濕度（75±5）%條件下，分別以椰樹心葉、半展葉、展葉飼養(yǎng)至5齡的椰心葉甲健康蟲體。

1.1.2供試寄主植物試驗中采用的植物材料為椰樹的心葉、半展葉、展葉，均采自海南省儋州市長坡鎮(zhèn)椰樹林場，試驗前將采自田間的葉片清洗干凈，晾干后備用。

1.2試驗方法

1.2.1不同生長階段椰樹葉片營養(yǎng)成分含量測定測定心葉、半展開葉、完全展開葉的營養(yǎng)成分含量。蔗糖含量測定采用紫外分光光度法[17]；淀粉含量測定采用紫外分光光度法[17]；粗纖維含量測定采用酸堿劑洗滌法[18]；粗蛋白含量測定采用微量凱氏定氮法[19]；粗脂肪含量測定采用索氏提取法[20]。

1.2.2酶液制備分別采集心葉、半展開葉和完全展開葉飼養(yǎng)的個體大小一致的椰心葉甲5齡幼蟲各10頭，在冰浴上解剖取其中腸，置于勻漿器中加入1 mL預(yù)先冰浴的蒸餾水在冰浴中勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，置于 -20 ℃ 冰箱冷藏，作為酶源備用。樣品蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[21]，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3淀粉酶活性測定淀粉酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[22]，并略加改進(jìn)。在5 mL試管中分別加入 320 μL 檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH值=5）、150 μL酶液以及250 μL 0.1%淀粉溶液，混勻后于35 ℃水浴中溫育 30 min，溫育結(jié)束后加入1 mL二硝基水楊酸（DNS）試劑以停止反應(yīng)。最后將反應(yīng)混合物沸水浴10 min，冷卻后于540 nm處讀取D540 nm。采用麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=5.032 6x-0.019 9，r=0.998 1；y為 540 nm 處吸光度；x為麥芽糖濃度，mg/mL）計算樣品反應(yīng)后麥芽糖含量。淀粉酶活性以單位時間、單位質(zhì)量樣品蛋白中麥芽糖的物質(zhì)的量[μmol/（mg·min）]表示。空白對照以緩沖液代替酶液。

1.2.4蔗糖酶活性測定蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[23]，并略加改進(jìn)。除反應(yīng)底物為1%蔗糖，緩沖液為磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值=6.5），反應(yīng)時間為 60 min，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=6.021 6x+0.008 3，r=0.999 1）外，其余步驟與“1.2.3”節(jié)中相同。

1.2.5纖維素酶活性測定纖維素酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[24]，并略加改進(jìn)。除反應(yīng)底物為2%羧甲基纖維素鈉（CMC），緩沖液為檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH值=6.0），反應(yīng)時間為60 min，反應(yīng)溫度為50 ℃，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=10.293 0x-0.027 5，r= 0.998 0）外，其余步驟與“123”節(jié)中相同。