洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系小孢子敗育的細胞形態(tài)學結構

程雨+宋策+陳典+王勇

摘要：為了探索洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系小孢子敗育的時間和形式，通過石蠟切片和電鏡技術對小孢子的發(fā)育進行觀察。結果表明，在花粉母細胞時期，不育系JA花藥室壁較保持系厚且有凹凸現(xiàn)象；在四分體時期，小孢子不飽滿呈月牙狀，絨氈層與藥室壁完全脫離，細胞質(zhì)濃縮、空泡化；在小孢子發(fā)育時期，小孢子細胞質(zhì)發(fā)生濃縮、降解、嚴重空泡化，絨氈層完全解體；在成熟花粉粒時期，小孢子完全干癟聚集在一起，花藥敗育。由此推測，洋蔥不育系JA小孢子發(fā)育異常始于花粉母細胞時期，在四分體時期呈現(xiàn)出敗育，敗育的原因在于絨氈層的提早解離。

關鍵詞：洋蔥；雄性不育；性狀轉(zhuǎn)育；四分體；小孢子；敗育；細胞形態(tài)學結構；絨氈層；解離

中圖分類號： S633.201文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0107-04

洋蔥（Allium cepa L.）為百合科蔥屬植物，別稱圓蔥、蔥頭，因其具有很好的食療保健作用和極高的藥用價值被譽為“菜中皇后”，在世界蔬菜生產(chǎn)面積上，排在馬鈴薯和番茄之后，位居第三[1]。我國是世界上洋蔥的第一大生產(chǎn)國和出口國，產(chǎn)地主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅、云南、山東、黑龍江等地[2]。洋蔥是最早育成并在生產(chǎn)上應用1代雜種的蔬菜作物之一[3]。洋蔥雜種優(yōu)勢明顯，自交衰退嚴重，其1代雜種一般能增產(chǎn)20%～50%，其應用價值已被生產(chǎn)實踐所證實[4-5]。但洋蔥為2年生異花授粉作物，其花器小，花期不集中，單花結籽率低，人工去雄成本高、難度大，因此利用雄性不育系是配制雜交種子的有效途徑[6] 。研究洋蔥細胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生機理對于 F1雜種的生產(chǎn)具有重要的作用。目前，洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系主要分3類，即S型、T型和近年發(fā)現(xiàn)的瓣化型，其中S型在生產(chǎn)上應用廣泛[7-9]。前人對洋蔥CMS細胞學研究表明，洋蔥花藥敗育大都與絨氈層發(fā)育有關，花粉母細胞沒有異常表現(xiàn)。絨氈層的發(fā)育異常大致可歸納為3種形式：一是在四分體時期，絨氈層細胞提前解體，不能供給小孢子生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)；二是在二分體時期，絨氈層過度肥大，而且會延遲解體，這2種類型中，絨氈層的解體總是發(fā)生在小孢子產(chǎn)生異常現(xiàn)象之前；三是絨氈層形態(tài)完全正常，只是存在時間過長[10-12]。一般研究認為，絨氈層細胞的異常死亡是造成小孢子敗育的主要原因；但也有研究表明，不育系與保持系絨氈層細胞變化不大。連高山等對某一洋蔥CMS研究發(fā)現(xiàn)，與可育系花粉母細胞相比，絨氈層細胞變化不大，但花粉母細胞次生壁和胼胝質(zhì)合成受阻，細胞壁變薄，細胞內(nèi)出現(xiàn)泡狀結構，有些泡狀體可相互融合，這種自噬現(xiàn)象的確與植物花藥敗育過程的細胞的敗育或者說程序化死亡有關[13]。不同的雄性不育材料間小孢子敗育發(fā)生的時期和原因并不完全一致，掌握敗育發(fā)生的時期和成因?qū)τ谛坌圆挥霓D(zhuǎn)育和在生產(chǎn)上的應用意義重大。本試驗對洋蔥不育系JA及其保持系JB花粉發(fā)育過程進行觀察分析，從形態(tài)學和細胞學上對洋蔥細胞質(zhì)雄性不育發(fā)生進行系統(tǒng)的跟蹤和比較，確定其不育發(fā)生的時期，推測不育發(fā)生的原因，從而為該不育系發(fā)生的生理學和分子生物學研究提供參考，進而為該雄性不育性狀的轉(zhuǎn)育和利用提供理論指導。

1材料與方法

1.1試驗材料

洋蔥雄性不育材料JA和保持系JB，由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院蔥蒜課題組發(fā)現(xiàn)并選育。2013、2014年秋分別將JA和JB的種球種植于東北農(nóng)業(yè)大學園藝站加溫溫室中，次年4月抽薹，開花后分別采集0.8～1.0、1.8～2.0、2.7～3.0、38～4.0 mm的花蕾，冰上剝離花藥備用（經(jīng)預試驗確定其對應典型發(fā)育時期為花粉母細胞時期、二分體和四分體時期、單胞花粉粒時期、成熟花粉粒時期）。

1.2試驗方法

1.2.1不育株與可育株的形態(tài)特征在播種期到開花期分別標記植株編號，定期到溫室中觀察不育系與保持系的形態(tài)特征并拍照記錄。

1.2.2花藥顯微結構在開花盛期將采集的不同時期花藥樣本，放入FAA固定液中固定，石蠟切片法制片，切成厚 6 μm 的蠟帶，用梅氏黏貼劑粘在載玻片上，1%番紅染色，05%固綠復染，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3花藥超微結構參考顯微結構觀察結果，將不同發(fā)育時期的花藥放入2.5%戊二醛進行前固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液進行漂洗，在1%四氧鋨酸固定液中固定2.5 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液進行漂洗，經(jīng)乙醇脫水后用1 ∶1比例的100%乙醇+100%丙酮脫水10 min，再用100%丙酮脫水10 min，固定及漂洗程序溫度均保持在4 ℃，浸透包埋后在超薄切片機上將其修成50～60 nm的小塊，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后在H-7650透射電鏡下觀察并照相。

2結果與分析

2.1不育株與可育株的形態(tài)特征

從幼苗期到開花期，洋蔥不育株與可育株外形比較整齊一致，生長勢無規(guī)律性差異，花球大小也無明顯差異，但花蕾從表型上容易區(qū)分，即不育系JA花蕾雖然開放，但花絲逐漸縮小干枯，花藥干癟無花粉，多呈墨綠色后變褐色；保持系JB花蕾外形飽滿，花絲發(fā)育正常，花藥飽滿，呈黃色（圖1）。

2.2花藥的顯微結構

2.2.1花粉母細胞時期洋蔥雄蕾原基分化發(fā)育成4個藥室（圖2-A、圖2-B），每個藥室的造孢細胞分化成若干個花粉母細胞。保持系JB花粉壁發(fā)育形狀規(guī)則，由圖2-C可以看出，花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層組成，中層細胞核清晰可見，絨氈層細胞核染色深，核較大排列在花粉母細胞周圍。不育系JA花粉母細胞發(fā)育正常，但花粉囊細胞形狀不規(guī)則，藥室壁較保持系厚有凹凸現(xiàn)象，中層發(fā)育遲緩，花粉母細胞周圍被絨氈層細胞緊緊包圍（圖2-D）。

2.2.2四分體時期保持系JB花粉母細胞經(jīng)過2次減數(shù)分裂形成四分體，也有未完成減數(shù)分裂的二分體存在，胞壁染色較淺，藥室表皮、內(nèi)壁發(fā)育成熟，中層細胞排列整齊，細胞核清晰可見，絨氈層發(fā)育達到頂點，絨氈層細胞質(zhì)濃郁發(fā)達，細胞核大、染色深（圖2-E）。不育系JA花粉母細胞正常發(fā)育成四分體，但幼嫩小孢子沒有保持系飽滿，似月牙狀（圖2-F），藥室表皮、內(nèi)壁細胞膨大，比可育系厚，而中層細胞無發(fā)育跡象，細胞核染色較淺，絨氈層完全脫離藥室壁，緊緊圍繞四分體和二分體，胞質(zhì)有明顯的濃縮現(xiàn)象并空泡化。

2.2.3游離小孢子時期保持系JB花藥中包圍四分體的胼胝質(zhì)解體，釋放出小孢子，小孢子細胞核染色深清晰可見，絨氈層胞質(zhì)降解，但其核染色仍較深，中層細胞沒有明顯變化，表皮和藥室內(nèi)壁高度發(fā)達，藥室內(nèi)壁出現(xiàn)纖維組織，細胞核染色較深（圖2-G）。不育系JA小孢子從表面看染色透明類似泡狀，中層細胞退化，絨氈層完全退化，看不到細胞核等結構，藥室內(nèi)壁形成粗大的纖維組織（圖2-H）。

2.2.4成熟花粉粒時期保持系JB絨氈層在供應花粉發(fā)育所需要的營養(yǎng)后完全解離，整個花粉粒染色較深，形狀飽滿，花粉粒均勻地分散在藥室內(nèi)，相鄰花粉囊相通，藥室內(nèi)壁纖維化細胞出現(xiàn)雙核（圖2-I）。不育系JA空癟的花粉粒收縮擠在一起，粗大的纖維組織加厚，不具有開裂腔結構，藥室嚴重收縮變形，內(nèi)壁幾乎貼在一起，纖維層不能形成裂口，花粉囊不相通（圖2-J）。

2.3花藥的超微結構

2.3.1四分體時期不育系JA絨氈層出現(xiàn)明顯胞質(zhì)收縮、染色質(zhì)濃縮、泡狀結構（圖3-A ）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溢滿、線粒體膨脹（圖3-B），小孢子形狀不均勻，細胞質(zhì)出現(xiàn)濃縮并有少量泡狀結構（圖3-C），所以從形態(tài)上推測不育系JA絨氈層細胞在四分體時期之前就開始了細胞編程性死亡（PCD）。保持系JB小孢子正常發(fā)育，核質(zhì)濃郁，沒有濃縮現(xiàn)象（圖3-D）。

2.3.2游離小孢子時期洋蔥游離小孢子時期，保持系JB絨氈層釋放胞質(zhì)內(nèi)容物幫助形成小孢子壁，出現(xiàn)降解現(xiàn)象（圖3-E、圖3-F），不育系JA絨氈層退化嚴重，雖然有類似小孢子壁結構但小孢子緊密聚集在一起，細胞器無法辨別，出現(xiàn)大量泡狀結構，不能正常發(fā)育（圖3-G）。

2.3.3成熟花粉粒時期保持系JB隨著絨氈層細胞內(nèi)容物的釋放，絨氈層形成線狀，但仍有殘留（圖3-H），花粉粒逐漸成熟，電子密度濃厚，染色很深（圖3-I）。不育系JA絨氈層無法辨別，花粉壁形成，但小孢子干癟、變形，內(nèi)容物只剩殘留，完全敗育 （圖3-J）。

3討論與結論

前人研究表明，植物雄性不育小孢子敗育在不同植物材料中發(fā)生時期有所差異，相同材料不同品種間也存在差異[14-17]。本研究中不育系JA在花粉母細胞時期，小孢子花粉母細胞正常發(fā)育，藥室表皮和內(nèi)壁細胞較保持系有加厚凹凸現(xiàn)象；在四分體時期出現(xiàn)敗育跡象，小孢子不飽滿呈月牙狀，超微觀察顯示小孢子出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮現(xiàn)象，絨氈層過度肥大，出現(xiàn)液泡，藥室表皮和內(nèi)壁細胞膨大；游離小孢子時期，小孢子細胞質(zhì)濃縮加重，堆積在一起無法正常發(fā)育；成熟花粉粒時期，小孢子空癟，孢子囊皺在一起，中層和絨氈層完全退化，藥室變形不開裂。筆者分析比較發(fā)現(xiàn)，小孢子在四分體時期出現(xiàn)敗育跡象；但是李園園等研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系63A四分體時期，四分體形成正常，而小孢子發(fā)育時期，小孢子細胞質(zhì)發(fā)生濃縮、降解，絨氈層完全解體[12]，這與杜敏霞等的研究結果[18]相似。而王瑞麗等研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系8A在花粉母細胞時期就發(fā)生了敗育[19]。小孢子敗育時期的差異可能是由材料不同造成的。

從形態(tài)學角度來看，大多數(shù)植物的小孢子敗育都涉及到了絨氈層的發(fā)育異常。絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層的特殊體細胞，與小孢子母細胞以及花藥發(fā)育后期的小孢子直接相互作用，在花粉發(fā)育過程中起著至關重要的作用，絨氈層以程序性死亡（PCD）的形式適時為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)和結構物質(zhì)，分泌胼胝質(zhì)酶，參與花粉粒外壁的形成，同時也為花粉的成熟提供空間。當環(huán)境條件改變或調(diào)控絨氈層細胞 PCD 的基因發(fā)生突變時，都會導致絨氈層細胞降解的提前或延遲，致使花粉發(fā)育受阻，并最終形成雄性不育[20-22]。王嬋等研究發(fā)現(xiàn)，大蔥不育系58A花藥絨氈層提前解體，影響了正常小孢子的形成，導致花粉敗育[23]。李園園等也認為，洋蔥不育系小孢子敗育與絨氈層提前衰退有關[12]，類似結論在辣椒[24]、油菜[25]、水稻[26]等作物上均有報道。洋蔥雄性不育系JA在四分體時期，絨氈層細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)、染色質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溢滿，線粒體膨脹等程序性死亡現(xiàn)象，而其保持系四分體時期絨氈層發(fā)育到頂點，但未出現(xiàn)退化現(xiàn)象，直到游離小孢子時期絨氈層才退化分解，由此推斷不育系絨氈層的提前解離是造成小孢子營養(yǎng)不足、逐漸凋亡，最終導致敗育的原因之一。

形態(tài)學上的表現(xiàn)是基因表達的結果，本研究確定了洋蔥不育系JA小孢子敗育的發(fā)生時期和直接原因；但有關分子信息的研究還不明確，如哪些基因引起絨氈層提早解離，小孢子敗育除了線粒體基因的表達，與核基因是否還存在著某種關聯(lián)，洋蔥的雄性不育發(fā)生機理的研究無論是對雄性不育的利用，還是對洋蔥的雜交制種都具有重要意義，這也是下一步研究的方向。

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