海水酸化條件下鉛脅迫對近江牡蠣過氧化氫酶活性的影響

李曉梅+郭體環+張來軍+李由明

摘要：為了研究在未來海洋酸化背景下重金屬對貝類免疫的影響，在實驗室條件下，設置0.05、0.50、5.00 mg/L 3種硝酸鉛濃度，以0.00 mg/L作為對照，比較正常海水（pH值8.0）、酸化海水（pH值7.6）背景下鉛脅迫對近江牡蠣鰓組織過氧化氫酶（CAT）活性的影響。結果表明：在正常海水（pH值8.0）條件下，鉛濃度為0.00、0.05、0.50 mg/L時，對近江牡蠣CAT活性表現為誘導效應，且誘導效應隨鉛濃度升高、脅迫時間延長而增強，至20 d時，各組間即表現出顯著差異（P<0.05）；鉛濃度為5.00 mg/L時，對近江牡蠣CAT活性的誘導效應快而強烈，至10 d時，近江牡蠣CAT活性遠高于其他各組（P<0.05），但隨后又逐漸減弱，至25 d時，與0.05 mg/L組相當，已顯著低于0.50 mg/L組（P<0.05）。酸化海水（pH值7.6）條件下，短期內無論鉛濃度高或低，均對近江牡蠣CAT活性呈現誘導效應，且鉛濃度越高，誘導效應越強；隨著脅迫時間延長，誘導效應呈下降趨勢，鉛濃度越高，CAT活性下降越快，至后期高濃度鉛對近江牡蠣CAT活性表現出抑制效應；至30 d時，0.00、0.05、0.50 mg/L組近江牡蠣CAT活性與對照組（pH值7.6、0.00 mg/L）相近，且3組間無明顯差異，但5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性顯著低于對照組（P<0.05）。由研究結果可見，酸化和鉛對近江牡蠣CAT的影響具有協同作用，當鉛濃度較低時，近江牡蠣CAT活性主要受pH值影響，當鉛濃度達到一定值（5.00 mg/L）后，近江牡蠣CAT活性主要受鉛濃度影響，雙重脅迫會增加近江牡蠣受損的程度。

關鍵詞：海洋酸化；鉛；鰓；CAT；近江牡蠣；健康養殖；過氧化氫酶活性

中圖分類號： S917.4；S968.31+6.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0165-04

重金屬是一類典型的環境污染物，環境中重金屬污染的來源主要是化工、采礦、金屬冶煉及加工、電鍍、輪船制造等行業，以及農用殺蟲劑、生活污水和垃圾滲出液等。對于生物體而言，組織內含有較低濃度鉛時就能對有機體產生顯著的毒性[1]，生物體會產生氧化應激反應，影響細胞的結構和功能[2]，因此需要抗氧化系統來對抗可能產生的細胞損傷。

過氧化氫酶（CAT）是機體抗氧化體系中非常關鍵的一種非特異抗氧化酶，能夠清除超氧化物歧化酶（SOD）催化活性氧自由基所產生的H2O2，使它轉化為對機體無毒的H2O、O2，后者和SOD共同作用可使機體免受氧自由基的攻擊[3]。

海洋酸化已被廣泛確認是CO2上升導致的又一重大環境問題[4]。化石燃料的使用等人類活動導致大氣中CO2濃度不斷升高，可能已經導致全球變暖和氣候異常等[5]，海洋不斷從大氣中吸收CO2，對緩解全球變暖起著重要的作用[6]。然而，自工業革命以來，海洋大量吸收人類排放的CO2，已導致上層海水pH值下降了0.1[7]。根據聯合國政府間氣候變化專門委員會（IPCC）預測模型（A1F1）的推測，至2100年大氣CO2濃度會升至800～1 000 μL/L，表層海水pH值將下降0.3～0.4，這種酸化速度在過去3億年間的任何一個時期都未有過[8]。海洋酸化引起的海洋化學變化（碳酸鹽系統及物質形態），正在改變海洋生物賴以生存的化學環境，海洋生物的代謝過程會受到影響，海洋生態的穩定性會發生變化[9]。海洋酸化引起的海水pH值的降低會改變海洋生物的多項生理功能，使海洋生物抵抗不良環境脅迫與疾病等能力降低，致使脅迫或疾病對海洋生物造成的損傷更嚴重，甚至在較低脅迫強度下造成生物個體死亡[10]。

近江牡蠣（Crassostrea rivularis）是我國主要牡蠣養殖種類之一，屬于半咸水種類，主要分布在華南沿海眾多河口地帶。由于近江牡蠣生活在河口區域，不斷有淡水經此流入海洋，再加上潮汐、海浪等的影響，近江牡蠣的生活環境經常發生劇烈變化，而且近江牡蠣不像其他海洋生物可以移動，可以趨利避害，而是固定在巖石或其他物體上生活，由此近江牡蠣自身形成了一系列應對環境脅迫的適應機制，是用于研究環境脅迫響應的很好的材料。目前，有關海洋酸化和鉛對貝類的生物學影響研究多是單一因素的，包括海洋酸化對貝類受精、發育、免疫、攝食和繁殖的影響[11-13]，以及鉛對貝類抗氧化酶活性的影響[2，14]等，很少有關于鉛和海洋酸化復合脅迫對貝類的影響研究。本研究探討了海水酸化和鉛復合脅迫對近江牡蠣CAT活性的影響，以期為近江牡蠣的健康養殖、棲息地環境檢測、防治污染和海洋環境保護等提供參考依據。

1材料與方法

1.1材料

本試驗所用近江牡蠣于2015年3月購自海南昌化，采捕后立即送至試驗場地，洗刷干凈后置于4 m×4 m×1.5 m的室內水泥池內暫養7 d，經測定，近江牡蠣采集地和試驗地海水中鉛含量均低于0.01 mg/L，無顯著性差異。暫養期間采用靜態換水法，每天換水1次，養殖用水為過濾海水，主要水環境因子按采樣地調控，水溫（27±1） ℃，pH值8.0，鹽度30‰，以金藻、青島大扁藻作為餌料，24h連續充氧。暫養結束后，死亡率<1%，符合試驗要求，挑選大小均勻[（10.36±183）g/只]的近江牡蠣個體作為受試生物。

以硝酸鉛作為污染物，將硝酸鉛（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）配制成 10 mg/mL的母液。按需要稀釋到相應的濃度，進行鉛脅迫試驗。

1.2海水處理

試驗前使用乙酸調配試驗所需酸化海水（pH值7.6），為防止調配好的海水在使用過程中pH值升高，經過反復試驗，最終采用輸液管勻速緩慢向試驗容器中滴加乙酸的方法穩定水體pH值。試驗以正常海水作為對照（pH值8.0）。

1.3試驗分組

GB 3097—1997《海水水質標準》中的4類海水和NY5052—2001《無公害食品 海水養殖用水水質》中規定鉛含量≤0.05 mg/L。已有試驗表明，鉛對近江牡蠣的96 h LC50為43.55 mg/L，本試驗以此為依據，按等比數列設計硝酸鉛濃度分別為0.05、0.50、5.00 mg/L的3個濃度組，以0.00 mg/L作為對照組（CK），每組均設置3個平行，各試驗組海水pH值及硝酸鉛濃度見表1。試驗在150 L塑料桶中進行，每桶加 100 L 試驗溶液，每組放入經暫養的近江牡蠣 50 只。試驗期間每24 h更換1次試液，以金藻、青島大扁藻作為餌料，試驗期間控制水溫（27±1） ℃，鹽度30‰，24h連續充氧。

1.4樣品制備

試驗開始的當天記為0 d，試驗開始后的5、10、15、20、25、30 d，從各桶隨機取3只近江牡蠣，每組9只，取鰓組織，稱質量，按1 ∶9（質量體積比）的比例添加預冷的生理鹽水，冰上勻漿，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，置于 -80 ℃ 超低溫冰箱內保存備用。

1.5CAT活性測定

CAT活性測定使用南京建成生物工程研究所研制的CAT檢測試劑盒（A007-1），按照試劑盒使用說明操作，每個待測樣品測試3次。

1.6數據分析

試驗數據用“平均值±標準差”表示。用Excel、SPSS等軟件進行單因素方差分析和圖表制作。

2結果與分析

2.1pH值為8.0時鉛對近江牡蠣CAT活性的影響

由圖1可見，正常海水（pH值8.0）條件下，鉛對近江牡蠣CAT活性的影響表現為在整個試驗期內，0.00、0.05、0.50 mg/L 3個處理組鉛對近江牡蠣CAT活性一直表現為誘導效應，而且誘導效應在一定范圍內隨鉛濃度升高、脅迫時間延長而增強，各組間差異也隨之增大；自15 d起，部分組間即表現出顯著差異（P<0.05），直至試驗結束；5.00 mg/L處理組在試驗前期誘導效應非常強，至10 d時近江牡蠣CAT活性顯著高于其他各組（P<0.05），而自15 d開始，5.00 mg/L處理組誘導效應逐漸減弱，15、20 d，5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性與 0.50 mg/L 組無明顯差異，隨著脅迫時間延長，5.00 mg/L 組近江牡蠣CAT活性繼續降低，至25 d時與 0.05 mg/L 組相當，已顯著低于0.50 mg/L組（P<0.05）。

試驗結果表明，在正常海水（pH值8.0）中，低濃度鉛對近江牡蠣CAT活性的誘導效應顯現得緩慢，但一直保持上升的趨勢；高濃度鉛對近江牡蠣CAT活性的誘導效應顯現得快而強烈，但隨后又逐漸減弱。

2.2pH值為7.6時鉛對近江牡蠣CAT活性的影響

由圖2酸化海水（pH值7.6）條件下鉛對近江牡蠣CAT活性的影響可見：在試驗開始后的前10 d，無論濃度高低的鉛對近江牡蠣CAT活性均表現為較強的誘導效應，且隨鉛濃度增大、脅迫時間延長，誘導效應逐漸增強；自15 d開始，各鉛濃度組的誘導效應均開始降低，鉛濃度越高降幅越大，至試驗結束時，0.00、0.05、0.50 mg/L組近江牡蠣CAT活性幾乎恢復至初始值，且3組間無顯著差異，僅5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性顯著低于起始值（P<0.05）。

試驗結果表明，在酸化海水（pH值7.6）中，短期內無論鉛濃度高低均對近江牡蠣CAT活性呈現誘導效應，鉛濃度越高，誘導效應越強；隨著脅迫時間延長，誘導效應呈下降趨勢，鉛濃度越高，CAT活性下降越快，至后期高濃度鉛對近江牡蠣CAT活性表現出抑制效應。

2.3不同pH值對近江牡蠣CAT活性的影響

為說明pH值對近江牡蠣CAT活性的影響，將不同鉛濃度條件下正常海水（pH值8.0）組和酸化海水（pH值7.6）組近江牡蠣CAT活性進行比較。

由圖3-a可見，當鉛濃度為0.00 mg/L時，正常海水組CAT活性基本保持不變，而酸化海水組CAT活性隨處理時間的延長出現較大波動，總體表現為先升高后降低，至5 d時，略高于正常海水組；隨后，酸化海水組CAT活性快速增強，至10 d時，二者表現出極顯著差異（P<0.01）；10 d后，酸化海水組CAT活性隨處理時間延長逐漸降低，至30 d時，與正常海水組基本相同。

由圖3-b可見，當鉛濃度為0.05 mg/L時，正常海水組CAT活性隨處理時間延長而緩慢增強；酸化海水組CAT活性則表現為先升后降的變化趨勢；二者在10、15 d呈極顯著差異（P<0.01），酸化海水組的CAT活性高于正常海水組；30 d時，正常海水組的CAT活性極顯著高于酸化海水組（P<001）。

由圖3-c可見，鉛濃度為0.50 mg/L時，正常海水組CAT活性隨處理時間延長而迅速升高；酸化海水組CAT活性則表現為先升后降的變化趨勢；前期酸化海水組的CAT活性升高較快，二者在10 d時差異極顯著（P<0.01），且酸化海水組的CAT活性高于正常海水組；15 d時正常海水組CAT活性繼續上升，而酸化海水組開始下降，二者差異顯著（P<005）；15 d后，正常海水組CAT活性繼續上升，而酸化海水組繼續下降，并且差異一直極顯著（P<0.01）。

由圖3-d可見，當鉛濃度為5.00 mg/L時，正常海水組和酸化海水組CAT活性均表現為先升后降的變化趨勢，前 15 d 均無顯著差異，自20 d開始酸化海水組CAT活性下降速度比正常海水組快，二者差異極顯著（P<0.01）。

在本試驗中，酸化海水（pH值7.6）組近江牡蠣的CAT活性無論鉛濃度高低，均呈現先升后降的趨勢，而正常海水（pH值8.0）組并不如此，當鉛濃度為0.00～0.50 mg/L時，近江牡蠣CAT活性逐漸升高，只有當鉛濃度為5.00 mg/L時，才呈現先升后降的變化趨勢。

以上試驗結果說明，當鉛濃度較低時，近江牡蠣CAT活性主要受pH值影響；隨著鉛濃度增加，鉛、pH值對近江牡蠣的影響出現協同作用；當鉛濃度達到一定值（5.00 mg/L）后，近江牡蠣CAT活性主要受鉛濃度影響，pH值對CAT活性的影響減弱。

3討論

已有研究表明，重金屬在海洋生物體內富集可誘導產生大量的活性氧自由基，如H2O2、O2-、·OH等，用以幫助機體清除進入體內的病原，但是過量的活性氧會導致生物體內細胞膜的脂質化程度加快，破壞生物體內的活性氧平衡，進而引起生物體的氧化損傷[15-16]。此時，生物體為避免活性氧對自身細胞的傷害，會自動激活體內的氧化應激系統——抗氧化防御系統，機體抗氧化防御系統是保障重金屬污染脅迫造成的活性氧平衡的重要調節體系，因而常被用作監測海洋重金屬污染物的候選生物標記物[17]。Regoli等指出，海洋生物的氧化應激通路中，CAT是防止活性氧分子形成必不可少的分子[16]。CAT的主要作用就是催化H2O2分解為H2O、O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的·HO。

本研究表明，在正常海水中，低濃度鉛對近江牡蠣CAT活性的誘導效應顯現得緩慢而持久，高濃度鉛對近江牡蠣CAT活性的誘導效應顯現得快，但隨后又出現抑制效應。鉛脅迫下近江牡蠣鰓組織的CAT活性表現為濃度依賴性、時間依賴性，這種在低劑量表現為刺激效應，而高劑量則表現為抑制效應的模式稱為“毒物興奮效應”[18]。

在本研究中，酸化脅迫使近江牡蠣CAT活性呈現先升后降的趨勢，說明近江牡蠣對短期的酸化脅迫可以通過啟動應激防御系統來降低自身受到的傷害，但是隨著脅迫時間延長，酸化造成的傷害已超過近江牡蠣防御能力范圍，導致其受到損傷，酶合成能力降低，進一步將影響近江牡蠣的正常生理活動。很多生理學研究表明，雙殼貝類、棘皮動物等可能最容易受到海洋酸化的影響，因為在它們體內幾乎沒有能力來緩沖酸化影響[9，11，19-20]。由酸化產生的結果是廣泛而深遠的，可能導致新陳代謝抑制[21]、能量存儲和生長率降低[22]。貝類等海洋生物生理相關功能的改變已經被用來評估海洋酸化的生態影響[23]。

本研究還顯示，酸化和鉛對近江牡蠣CAT活性的影響具有協同作用，在它們單獨存在都會對近江牡蠣造成一定損害的前提下，雙重脅迫會增加近江牡蠣受損的程度。本試驗僅揭示了酸化和鉛對近江牡蠣的影響，而海洋中還存在大量如銅、鎘等其他有毒有害的重金屬，它們之間是否也存在類似的協同效應，尤其值得關注。一個更大的隱憂是海洋酸化將使越來越多的重金屬從海洋沉積物中釋放出來，酸化越嚴重，重金屬釋放得也越多，對海洋生物的毒害就越深。因此，建立全面系統的海洋酸化-重金屬污染評估體系是急迫且必要的。

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