無機鹽對甘草愈傷組織生長及總黃酮含量的影響

柳福智，楊秀艷

(甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070)

?

無機鹽對甘草愈傷組織生長及總黃酮含量的影響

柳福智*，楊秀艷

(甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070)

本研究以甘草無菌苗的下胚軸為供試材料,以MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+agar 8 g/L+sugar 30 g/L為基本培養基，利用組織培養技術并結合紫外分光光度法探究了MS培養基中5種不同無機鹽濃度及各種成分之間的交互作用對甘草愈傷組織增長量、生理指標及次生代謝產物的影響。結果表明，適量增加KNO3和MnSO4·4H2O的含量有利于甘草愈傷組織生物量的積累；隨著MS培養基中CaCl2·2H2O濃度的增加，有利于可溶性糖和總黃酮含量的積累；濃度為2533 mg/L KNO3最有利于提高POD活性；KH2PO4濃度在170～226 mg/L范圍內，愈傷組織生長量和總黃酮含量顯著提高；MS培養基中MgSO4·7H2O有利于甘草愈傷組織的生長及總黃酮的合成。而愈傷組織的生長狀況與總黃酮的合成是多種無機鹽離子之間交互作用的結果，通過正交試驗及極差分析得出最優營養元素組合為MgSO4·7H2O 493 mg/L+MnSO4·4H2O 7 mg/L+KNO32533 mg/L+KH2PO4170 mg/L+CaCl2·2H2O 733 mg/L。

甘草；愈傷組織；無機鹽；次生代謝

甘草(Glycyrrhizauralensis)為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生、耐旱、耐鹽堿的深根性草本植物[1-2]，廣泛分布于北緯45°的干旱半干旱地區。以根和根莖入藥，具有補脾益氣、止咳祛痰、抗潰瘍、抗氧化、抗癌、保肝等功效，素有“十方九草，無草不成方”之說[3-7]。甘草除藥用外，也作為食品、飲料、飼料、卷煙和化妝品行業用；也是荒漠或半荒漠地區重要防風固沙、改良土壤的植物，具有生態和經濟雙重價值[8]。近年來，隨著全世界對甘草需求量的劇增，野生資源破壞嚴重，造成土地沙化面積增加，草場質量惡變，生態環境極其脆弱，甘草遂成為干旱半干旱地區亟待保護的植物資源。

目前，甘草培育以野生馴化和農家種植為主，栽培年限長達3年多，栽培甘草與野生甘草的各項光合特性指標均較接近，受強光的抑制作用不明顯，才可有較強的光合作用[9]，而且在生產中存在種子硬實嚴重、成苗率低、生長早期植株弱小、蟲草害嚴重、自然栽培采收種子晚(至少栽培4年才能采收種子)、地下根莖進行無性繁殖系數低等問題，極大地限制了甘草的大面積推廣應用和育種工作的開展[10]。因此，利用組織培養技術對甘草進行無性快繁，加快甘草次生代謝活性物質的提取已迫在眉睫。有關甘草組織培養多為愈傷組織誘導與分化方面的研究較多[11-15]，而培養基類型及其中營養元素的濃度及培養條件對愈傷組織生長及次生代謝產物含量的積累有很大影響。研究表明[16-18]，在培養基中添加不同質量分數的酵母提取物、水解酪蛋白、真菌誘導子、茉莉酸、稀土元素、碳源和氮源等可以有效地提高甘草愈傷組織中黃酮類化合物的合成；李琰等[19]研究了杜仲(Eucommiaulmoides)愈傷組織中不同次生代謝產物的積累對培養基中營養元素有最適要求，可見不同的植物或同種植物生物量的積累及次生代謝產物的大量合成對培養基中無機鹽濃度有要求差異。有研究表明，不同濃度的氮源對愈傷組織的誘導和生長有顯著的影響[20]，不同的碳源對愈傷組織細胞生長及次生代謝產物的合成不一致，適宜的外源硅濃度對鹽脅迫下甘草幼苗的生長有一定的緩解作用[21]，若培養基中銨鹽濃度過大會影響細胞生長[22]。即營養元素種類及濃度在細胞的生長和次生代謝過程中有著重要的作用，而且細胞的生長及次生代謝產物的合成是多種營養元素共同作用的結果，黃亞萍等[23]只從植物水平研究了氮磷鉀配施對甘草育苗質量的影響，但有關MS培養基(Murashige and Skoog)中不同無機鹽的濃度對甘草愈傷組織生長及次生代謝產物影響的研究國內鮮見報道。本研究以甘草無菌苗的下胚軸為外植體材料，通過研究MS培養基中5種不同濃度的無機鹽對甘草愈傷組織的生物積累量、POD活性、可溶性糖及總黃酮含量等因素的影響，來探究營養元素對甘草愈傷組織生長及次生代謝產物的影響；通過優化5種無機鹽濃度水平及多因素多水平正交試驗，確立最優的營養元素培養組合，以期提高甘草愈傷組織生長率及次生代謝產物含量，通過快速繁殖來緩解甘草市場需求，對保護甘草資源提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗處理

1.1.1 試驗時間 本試驗始于2014年12月25日，終于2015年12月25日。

1.1.2 試驗材料 以甘草種子無菌苗的下胚軸為供試材料。

1.1.3 無菌材料的獲得 挑選優質的甘草種子，用98%濃硫酸處理30～40 min[24]，無菌水沖洗3～5次，75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3～5次，0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸取種子表面的水分。于超凈工作臺上將處理過的甘草種子接種到經滅菌、不含任何激素的MS培養基中[25]。每瓶接入6粒無菌甘草種子，置培養架上，在溫度為(25±1) ℃、光照時間為12～16 h/d、濕度為50%～70%的培養室條件下，使三角瓶中的種子發芽，生長15 d左右可獲得甘草無菌苗。

1.1.4 愈傷組織的誘導 將已培養了15 d左右的無菌苗下胚軸作為外植體，切成0.3 cm左右的小段，在無菌條件下接種于已優化的MS+6-BA(6-芐氨基嘌呤)0.5 mg/L+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.5 mg/L+NAA(萘乙酸)0.5 mg/L+KT(6-糠氨基嘌呤)0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L的愈傷組織誘導培養基中(pH=5.8)，暗培養4 d后，開始光照培養20 d可誘導出甘草愈傷組織。

1.1.5 愈傷組織的生長 篩選質地疏松、生長旺盛的甘草愈傷組織，在無菌條件下切成大小0.3 cm的愈傷組織小塊，經MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L進行繼代增值培養后，用作供試材料。試驗以添加6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L為基礎，將MS培養基中的KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 5種無機鹽設計成濃度梯度。單因素試驗以MS[n/3MS(KNO3)]，n=1, 2, 3, 4, 5。其他MS培養基中的營養元素的濃度均不變，無機鹽濃度單位是mg/L，上述同樣的方法對其他5種無機鹽分別進行試驗，即 KNO3的考察濃度為：633，1266，1900，2533，3166；KH2PO4的考察濃度為：56，113，170，226，283；CaCl2·2H2O的考察濃度為：146，293，440， 586，733；MgSO4·7H2O的考察濃度為：123，246，370，493，616；MnSO4·4H2O的考察濃度為：7，14， 22，29，37。試驗重復3次，每個處理接種20瓶，每瓶接入4塊大小相近的愈傷組織，接種的愈傷組織鮮重控制在0.10～0.20 g之間。愈傷組織生長條件與無菌苗獲得條件相同。經25 d后，計算5個處理的增長量(g/flask)、可溶性糖含量(%)、總黃酮含量(%)、POD活性[U/(g·min)]，優化培養基，進行多因素多水平的正交試驗，找到最優營養元素組合。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 增長量的計算 將培養 25 d的愈傷組織分別取出 (不同無機鹽及同一無機鹽不同濃度培養的愈傷組織每批取樣 20個),用濾紙將其表面附著的培養基吸去，置于萬分之一的分析天平上進行稱重，然后取其平均值即得組織的鮮重。將稱過鮮重的組織，置于烘箱中，首先在 105 ℃下烘 30 min，使其酶系滅活；再在 60 ℃下烘 3～4 h，使其干燥至恒重。算其相應處理的增長量，愈傷組織增長量=收獲量/瓶-接種量/瓶。

1.2.2 可溶性糖含量的測定 甘草愈傷組織中的可溶性糖主要是指溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖，可利用沸水浴提取和苯酚法測定其含量[26]。公式如下：

可溶性糖含量(%)=(CVT/106WVs)×100

式中：C為從標準曲線查得的葡萄糖量(μg)；VT為樣品提取液總體積(mL)；Vs為顯色時取樣品液量(mL)；W為樣品重(g)。

1.2.3 總黃酮含量的測定 精密稱取已研磨的甘草愈傷組織0.200 g，以75%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶50，浸泡樣品30 min后超聲提取40 min，過濾。濾渣以1∶30料液比超聲提取30 min，過濾。合并2次的濾液，用75%乙醇定容至25 mL。精密吸取提取液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加提取液而加其他相應試劑為空白，在500 nm處測吸光度，平行測定3次。公式如下：

P={[(A+0.00193)×5×V]/0.01075×m×106}×100%

式中：P為總黃酮含量；A為吸光度值；5為稀釋倍數；V為提取液體積(mL)；m為愈傷組織的干重(g)。

1.2.4 過氧化物酶(POD)活性的測定 精密稱取2 g新鮮甘草愈傷組織，剪碎置于研缽中，然后加5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.5)緩沖液,冰浴研磨，以4000 r/min離心15 min，取上清液，殘渣可用5 mL緩沖液提取一次，合并兩次上清液,置冷處備用。過氧化物酶(POD)活性的測定按愈創木酚氧化法，反應液用紫外分光光度法于波長470 nm比色測定。

1.3 數據統計分析

每個處理的不同濃度每次測定重復3次，用SPSS 19.0對數據進行顯著性(P<0.05)、極顯著(P<0.01)及標準差分析，使用Excel 2007軟件進行實驗數據處理。

2 結果與分析

2.1 KNO3濃度對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

MS培養基中KNO3的濃度范圍在633～3166 mg/L內，甘草愈傷組織的生長受到了促進，愈傷組織鮮重隨KNO3濃度的增加而極顯著性增加，因KNO3各個濃度愈傷組織鮮重含水量不同，在633～1266 mg/L和2533～3166 mg/L范圍內干重增長差異不明顯(表1)。總黃酮含量隨KNO3濃度的增加而明顯下降，可溶性糖含量和POD活性的最適濃度分別為1900和2533 mg/L，最高含量分別為(0.7866±0.004)%和(56.5543±0.358) U/(g·min) (表1)。不同濃度KNO3的愈傷組織生長狀況與次生代謝產物含量不呈正相關，這說明愈傷組織生長和次生代謝產物的積累對無機鹽濃度的要求不同(表1)。

表1 不同濃度KNO3對愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of KNO3 on callus growth and secondary metabolites

注：數值用平均數±標準差表示，同列標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Notes:Values are Means±standard deviation, followed by different lowercase letters within column differ significantly (P<0.05); followed by different uppercase letters within column differ significantly (P<0.01), the same below.

2.2 KH2PO4濃度對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

KH2PO4在56～283 mg/L的范圍內愈傷組織的增長量極顯著的呈先上升后下降的趨勢，但以MS培養基中 KH2PO4的原濃度170 mg/L生長最適(表2)；而總黃酮和可溶性糖含量隨著處理濃度的增加而極顯著升高，在濃度達到226 mg/L時含量達最大(表2)。POD是活性較高的一種與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等有關的酶，在170～226 mg/L的濃度內含量相對較高，這也表明在這個濃度范圍內愈傷組織易老化，顏色翠綠且質地硬，這是因為POD能使組織中所含碳水化合物轉化為木質素，增加木質化程度，即POD的活性可作為組織老化的一種生理指標(表2)。

表2 不同濃度KH2PO4對愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of KH2PO4 on callus growth and secondary metabolites

2.3 MgSO4·7H2O濃度對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

在123～370 mg/L范圍內，隨MgSO4·7H2O濃度的變大，甘草愈傷組織生長受到極顯著的促進作用(P<0.01)(表3)，說明濃度低于370 mg/L的MgSO4·7H2O不會對愈傷組織有脅迫作用，濃度在370～493 mg/L范圍時愈傷組織生長最好，但MS培養基中MgSO4·7H2O原濃度有利于黃酮和可溶性糖含量的積累，增加或減少MS培養基中MgSO4·7H2O的濃度都極顯著地抑制了總黃酮和可溶性糖的形成，最高含量分別為(0.3530±0.009)% 和(0.8135±0.008)%；POD的活性在246～493 mg/L內差異較小。

2.4 CaCl2·2H2O濃度對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

在146～733 mg/L范圍內，增加CaCl2·2H2O的濃度，明顯地抑制了愈傷組織的增長量，生長狀況下降，但總黃酮含量和可溶性糖含量變化明顯且在試驗最大濃度733 mg/L時兩種產物含量最高；而相同外植體愈傷組織的POD活性隨 CaCl2·2H2O濃度水平的變動格局存在差異，在培養基原濃度時POD活性最強(表4)。

2.5 MnSO4·4H2O濃度對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

MnSO4·4H2O是MS培養基中為甘草愈傷組織提供微量元素的無機鹽，當濃度小于29 mg/L，愈傷組織的生物積累量極顯著的呈先減小后增加的趨勢，超過29 mg/L時，破壞了養分平衡，愈傷組織生長不明顯，而MnSO4·4H2O的濃度大于7 mg/L會極顯著脅迫甘草愈傷組織中可溶性糖的合成，在試驗濃度內POD活性和總黃酮含量差異極顯著，而在培養基原濃度22 mg/L時含量積累最高(表5)。

表3 不同濃度MgSO4·7H2O對愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of MgSO4·7H2O on callus growth and secondary metabolites

表5 不同濃度MnSO4·4H2O對愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響Table 5 Effects of different concentrations of MnSO4·4H2O on callus growth and secondary metabolites

2.6 不同營養元素優化組合對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響

經過優選的5種無機鹽濃度3個水平的正交試驗，發現各個優化組合對甘草愈傷組織的生物量的積累及次生代謝產物的大量合成影響格局較大(表6、7)。對試驗結果進行多指標的極差分析，5種無機鹽離子對愈傷組織的生長狀況和所測次生代謝產物的積累影響力的大小依次為：MgSO4·7H2O>MnSO4· 4H2O>KNO3>KH2PO4>CaCl2·2H2O，最好的培養組合為C3E1A2B2D3，即在MgSO4·7 H2O 493 mg/L、MnSO4· 4H2O 7 mg/L、KNO32533 mg/L、KH2PO4170 mg/L、CaCl2·2H2O 733 mg/L。可見鎂元素是影響高產優質的甘草次生代謝產物的主因素，葉綠素的形成需要鎂，鎂是葉綠素的中心金屬元素，愈傷組織細胞中鎂含量的高低直接影響細胞對CO2的同化能力，進而影響細胞的生長和次生代謝產物的合成(表8)。

表6 因素水平 Table 6 Factors and levels mg/L

A: KNO3濃度 Concentration; B: KH2PO4濃度Concentration; C: MgSO4·7H2O 濃度Concentration; D: CaCl2·2H2O 濃度Concentration; E: MnSO4·4H2O 濃度Concentration.下同The same below.

表7 不同營養元素優化組合對愈傷組織生長及次生代謝產物的影響Table 7 Effects of different medium component optimization on callus growth and secondary metabolites

表8 不同營養元素優化組合 Table 8 Different medium component optimization

注：表8中的試驗序列號和表7的試驗序列號一樣，代表每一個試驗處理。其中，k1、k2、k3分別代表的是各個營養元素優選濃度水平為1、2和3下5個測量指標的總和，R代表的k1、k2和k3之間的極差，這是綜合考察的方法。

Note: The test sequence numbers in Table 8 are the same as the numbers in Table 7, and represent each test treatment. Where k1, k2, k3 represent respectively the sum of the five measurement indices at the preferred concentration levels 1, 2 and 3 of each nutrient element, and R represents the difference between k1, k2 and k3, which is a comprehensive survey method.

3 討論

培養基中的營養元素是愈傷組織細胞生長及初生代謝過程中化合物合成的物質基礎，但植物種類的不同適合的培養基中無機鹽濃度也不同[27]。對愈傷組織而言，較高濃度的無機鹽有利于愈傷組織的生長，較低濃度的鹽反而有利于次生代謝產物的大量合成[28]。因有此濃度效應，所以增殖細胞數量及獲得次生代謝產物應選用不同濃度的培養基以滿足所需。本試驗研究了MS培養基中的KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O五種無機鹽的不同濃度對甘草愈傷組織的生物積累量、POD活性、可溶性糖含量和總黃酮合成的影響。結果表明，在試驗范圍內增加培養基中KNO3和MnSO4·4H2O的含量有利于甘草愈傷組織細胞生物量的積累，而增加CaCl2·2H2O的濃度反而使愈傷組織生長狀況下降，培養基中KH2PO4和MgSO4·7H2O的原濃度均有利于愈傷組織生長，黃酮的最佳積累濃度1/3MS(KNO3)、4/3MS(KH2PO4)、3/3MS(MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O)、5/3MS(CaCl2·2H2O)；無機鹽濃度為3/3MS(KNO3、MgSO4·7H2O)、5/3MS(CaCl2·2H2O)、4/3MS(KH2PO4)、1/3MS(MnSO4·4H2O)時愈傷組織中的可溶性糖含量最高；MS培養基中的無機鹽原濃度對POD的合成較適宜。用統計分析的方法對培養基中5種無機鹽進行水平篩選，通過優化的5種無機鹽3個水平的正交試驗和極差分析，探明了各種無機鹽成分對愈傷組織生物量積累與次生代謝產物合成的交互作用，得到了最優培養基是C3E1A2B2D3。為進一步穩定甘草愈傷組織有效生長速率和有效成分的大量合成，建立了穩定、高產的甘草愈傷組織生長及次生代謝產物生產體系。

綜上所述，MS培養基中不同濃度的無機鹽對愈傷組織生長狀況與次生代謝產物含量無相關性，而且不同的次生代謝產物對營養元素的種類、數量和比例有不同的要求。這也證實了愈傷組織生長和次生代謝產物的形成對培養基中無機鹽濃度要求差異很大。造成這種格局主要因為：1)細胞的生長及次生代謝產物的合成需要營養元素的參與，不同濃度的營養元素會影響培養基的滲透勢，過高的滲透勢使細胞失水，造成生理干旱，影響細胞的正常代謝，從而導致細胞生長緩慢[29]。在高鹽的培養基中，細胞為了平衡滲透脅迫，體內會大量積累可溶性糖等滲透調節物質，使細胞保持較低的滲透勢，提高了愈傷組織的滲透調節能力，可改善水分關系[30]；細胞中會產生大量的活性氧自由基，破壞細胞膜、使生物大分子變性、許多代謝酶失活，進而使細胞的新陳代謝紊亂，但是細胞自身抗氧化系統中的過氧化物酶，它是一種保護劑，可以清除活性氧自由基，提高愈傷組織的抗逆性，而且黃酮類物質也可以提高細胞的抗氧化能力[31-32]。2)培養基中營養元素的吸收情況與愈傷組織吸收養分基因型的差異、細胞膜系統的離子交換量、酶活性、植物激素和植物毒素等有關，根據細胞內代謝活動的需要而進行選擇性吸收。植物體內的硝酸還原酶的活性強烈影響植物對硝酸鹽的吸收與利用，而植物體內酶的合成受某些基因的調控，進而影響了甘草愈傷組織細胞的生長及次生代謝產物合成中一些關鍵酶的合成[33]。營養元素對細胞內某些化合物的生物合成有調控作用，馬生軍等[34]以一年生甘草移栽苗為供試材料，研究表明適量濃度的錳對甘草SQS1(鯊烯合成酶1)基因的表達和甘草酸的積累具有一定的促進作用。所以植物對養分的吸收與積累動態主要受控于植物本身的遺傳特性，但對植物營養基因的研究正處于方興未艾的時刻，目前關于一個基因控制某種元素的吸收與利用的研究已被一些植物營養和遺傳學者所關注。

References：

[1] Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[S]. Beijing: Chemical Industry Press, 2015: 59-63. 藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. 北京: 化學工業出版社, 2015: 59-63.

[2] Li X B, Chen L, Li G Q,etal. Ecological distribution and propagative technique research ofGlycyrrhizauralensisresources in China. Journal of Ecological Environment, 2013, 22(4): 718-722. 李學斌, 陳林, 李國旗, 等. 中國甘草資源的生態分布及其繁殖技術研究. 生態環境學報, 2013, 22(4): 718-722.

[3] Liang B, Yang A F, Huang F L,etal. Research advances on chemical constituents and pharmacological activities inGlycyrrhiza. Journal of Northeast Agricultural University, 2006, 37(1): 115-119. 梁冰, 楊愛馥, 黃鳳蘭, 等. 甘草屬(Glycyrrhiza)化學成分及藥理作用研究進展. 東北農業大學學報, 2006, 37(1): 115-119.

[4] Sun Y, Ai Y N R, Yan X H,etal. Research progress on the extraction methods and pharmacological effects of flavonoids from licorice. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine, 2009, 27(1): 72-75. 孫蕓, 阿依努爾·吾買爾, 燕雪花, 等. 甘草黃酮的提取方法及藥理作用研究進展. 新疆中醫藥, 2009, 27(1): 72-75.

[5] Gao X Y, Wang W Q, Wei S L,etal. Review of pharmacological effects ofGlycyrrhizaradixand its bioactive compounds. Chinese Journal of traditional Chinese Medicine, 2009, 34(21): 2695-2700. 高雪巖, 王文全, 魏勝利, 等. 甘草及其活性成分的藥理活性研究進展. 中國中藥雜志, 2009, 34(21): 2695-2700.

[6] Zhang B, Guan Y P, Tian Q L,etal. Advances in the study on the chemical constituents of flavonoids in Ural. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 28(9): 1362-1365. 張波, 官月平, 田慶來, 等. 烏拉爾甘草中黃酮類化學成分的研究進展. 中國藥學雜志, 2006, 28(9): 1362-1365.

[7] Chen H. An overview of the pharmacological effects of licorice. Strait Pharmaceutical Journal, 2005, 17(4): 37-41. 陳紅. 甘草藥理作用概述. 海峽藥學, 2005, 17(4): 37-41.

[8] Wang Z L, Du J C, Yu L Q,etal. Utilization value, research status and existing problems of licorice. Grassland in China, 2002, 24(1): 73-76. 王照蘭, 杜建材, 于林清, 等. 甘草的利用價值、研究現狀及存在問題. 中國草地, 2002, 24(1): 73-76.

[9] Zhao Z H, Cao J G, Wang W J,etal. Comparative study on the photosynthetic characteristics between the cultivatedGlycyrrhizauralensiswith different age limits and the wildG.uralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2005, 14(3): 111-116. 趙則海, 曹建國, 王文杰, 等. 不同生長年限栽培甘草與野生甘草光合特性對比研究. 草業學報, 2005, 14(3): 111-116.

[10] Li M, Jiang Q, Zhang Q Y,etal. Study on the artificial cultivation technology of the arid zone in the middle of Ningxia Province. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005, 21(1): 144-148. 李明, 蔣齊, 張青云, 等. 寧夏中部干旱帶甘草人工種植技術研究. 中國農學通報, 2005, 21(1): 144-148.

[11] Liu X, Wang Q, Yu B. Effects of different hormone combinations on callus induction and browning ofGlycyrrhizainflateBata. Journal of Gansu Agricultural University, 2010, 45(6): 88-93. 劉昕, 王清, 余斌. 不同外源激素對脹果甘草愈傷組織誘導及褐化的影響. 甘肅農業大學學報, 2010, 45(6): 88-93.

[12] Hu H Y, Wu X L, Liang X H. Induced cultivation ofGlycyrrhizainflataBatal callus. Pharmaceutical Biotechnology, 2004, 11(3): 170-172. 胡海英, 吳曉玲, 梁新華. 脹果甘草愈傷組織誘導培養. 藥物生物技術, 2004, 11(3): 170-172.

[13] Lei C, Li P. Study on embryogenic callus induction ofGlycyrrhizainflateBat. Academic Journal of Second Military Medical University, 2010, 31(8): 909-911. 雷呈, 李斐. 脹果甘草胚性愈傷組織的誘導研究. 第二軍醫大學學報, 2010, 31(8): 909-911.

[14] Ge S J, Li G M, Ma Z Y,etal. Establishment of micropropagation system ofGlycyrrhizauralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2007, 16(6): 107-112. 葛淑俊, 李廣敏, 馬峙英, 等. 烏拉爾甘草組培再生體系的研究. 草業學報, 2007, 16(6): 107-112.

[15] Ma W F, Huang H Y, Wang Q. Effect of exogenous hormone on callus induction and chromosome doubling ofGlycyrrhizauralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(3): 142-145. 馬文芳, 黃惠英, 王清. 外源激素對甘草愈傷組織誘導及染色體加倍的影響(簡報). 草業學報, 2008, 17(3): 142-145.

[16] Yang S H, Liu X F, Guo D A,etal. Effects of medium and culture conditions on callus growth and flavonoids synthesis in licorice. Journal of Jilin Agricultural University, 2005, 27(3): 289-292. 楊世海, 劉曉峰, 果德安, 等. 培養基及培養條件對甘草愈傷組織生長和黃酮類化合物合成的影響. 吉林農業大學學報, 2005, 27(3): 289-292.

[17] Yang S H, Tao J, Liu X F,etal. Effects of carbon source and nitrogen source on callus growth and flavonoid content inGlycyrrhizauralensis. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 31(22): 1857-1859. 楊世海, 陶靜, 劉曉峰, 等. 培養基中碳源和氮源對甘草愈傷組織生長和黃酮類化合物合成的影響. 中國中藥雜志, 2006, 31(22): 1857-1859.

[18] Yang S H, Liu X F, Guo D A,etal. Effects of different additives on the formation of flavonoids inGlycyrrhizauralensiscallus. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 41(2): 96-99. 楊世海, 劉曉峰, 果德安, 等. 不同附加物對甘草愈傷組織培養中黃酮類化合物形成的影響. 中國藥學雜志, 2006, 41(2): 96-99.

[19] Li Y, Zhang C H, Ma X H. Effect of medium composition on the growth and secondary metabolites of callus. Journal of Wuhan Botanical Research, 2004, 22(4): 359-363. 李琰, 張朝紅, 馬希漢. 培養基成分對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響. 武漢植物學研究, 2004, 22(4): 359-363.

[20] Kim S H, Kim S K. Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of ‘Sheridan’ grapes. Journal of Plant Biotechnology, 2002, 4(2): 83.

[21] Cui J J, Zhang X H, Li Y T,etal. Effects of exogenous Si on the morphological and physiological indexes of licorice seedlings under salt stress. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(10): 214-220. 崔佳佳, 張新慧, 李月彤, 等. 外源Si對鹽脅迫下甘草幼苗形態及生理指標的影響. 草業學報, 2015, 24(10): 214-220.

[22] Chen Y C, Yi F, Cai M,etal. Effect of amino acids, nitrate, and ammonium on the growth and taxol production in cell cultures ofTaxusyunnanensis. Plant Growth Regulation, 2003, 41: 265-2681.

[23] Huang Y P, Chen Y, Guo F X,etal. Effect of N,P,K combination fertilization on the cultivation quality ofGlycyrrhizauralensisseedlings. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(2): 233-240. 黃亞萍, 陳垣, 郭鳳霞, 等. 氮磷鉀配施對甘草育苗質量的影響. 草業學報, 2012, 21(2): 233-240.

[24] Yang R, Wang L Q, Liu Y. Research progress on tissue culture of licorice. Chinese Herbal Medicine, 2014, 45(12): 1796-1802. 楊瑞, 王禮強, 劉穎. 甘草組織培養的研究進展. 中草藥, 2014, 45(12): 1796-1802.

[25] Liu F C, Lv J M, Wu X Z,etal. Significant impact of different induction conditions on metabolic diversity of callus cell lines ofGlycyrrhizasp. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2013, 38(23): 4056-4060. 劉鳳彩, 呂建明, 吳秀禎, 等. 誘導培養條件顯著改變甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性. 中國中藥雜志, 2013, 38(23): 4056-4060.

[26] Zhao H Q. The Basic Biology Experimental Guide of Plant Physiology[M]. Beijing: China Agricultural University Press, 2008: 80-82. 趙海泉. 基礎生物學實驗指導植物生理學分冊[M]. 北京:中國農業大學出版社, 2008: 80-82.

[27] Li Y, Feng J T, Wang Y H,etal. Effects of basic media and culture conditions on callus growth and secondary metabolite content ofTripterygiumwilfordii. Forestry Science, 2010, 46(5): 64-69. 李琰, 馮俊濤, 王永宏, 等. 培養基及培養條件對雷公藤愈傷組織生長和次生代謝產物含量的影響. 林業科學, 2010, 46(5): 64-69.

[28] Shangguan X C, Guo C L, Jiang Y. A study on effects of media and plant hormones on callus induction ofCyclocaryapaliurus(Bata.l) iljinskaja stems and leavesinvitro. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis, 2006, 28(5): 678-682. 上官新晨, 郭春蘭, 蔣艷. 培養基和植物激素對青錢柳莖段和葉片愈傷組織誘導的研究. 江西農業大學學報, 2006, 28(5): 678-682.

[29] Ge S J, Li X F, Tan B H,etal. Effect of different dispose on seed germination and peroridase (POD) enzymes ofGlycyrrhizauralensisFisch. Seed, 2008, 27(9): 42-45. 葛淑俊, 李秀鳳, 譚冰海, 等. 不同處理對烏拉爾甘草種子發芽率及過氧化物酶活性的影響. 種子, 2008, 27(9): 42-45.

[30] Yang F, Liu Q L, Dai Z Z,etal. Effects of different explants and basic medium on callus induction and differentiation ofAgavesisalana. Journal of Tropical Crops, 2012, 33(3): 475-478. 楊峰, 劉巧蓮, 代真真, 等. 不同基本培養基和外植體對劍麻愈傷組織誘導及分化的影響. 熱帶作物學報, 2012, 33(3): 475-478.

[31] Wang B J, Gao J F, Su W,etal. Influence of culture condition on callus growth and flavonoids biosynthesis of buckwheat. Journal of Nuclear Agriculture, 2013, 27(5): 591-597. 王鵬姬, 高金鋒, 蘇旺, 等. 培養條件對蕎麥愈傷組織生長及黃酮合成的影響. 核農學報, 2013, 27(5): 591-597.

[32] Meng C N, Liu C, He J M,etal. The effects of increased UV-B radiation,NaCl stress and their combined treatment on the photosynthesis and flavone metabolism in wheat seedlings. Photon Journal, 2005, 34(12): 1868-1871. 孟朝妮, 劉成, 賀軍民, 等. 增強UV-B輻射、NaCl脅迫及其復合處理對小麥幼苗光合作用及黃酮代謝的影響. 光子學報, 2005, 34(12): 1868-1871.

[33] Wang Y, Tang H R. Effects of nitrate on the growth and nitrate reductase activity in phaeocystis globosa. Chinese Bulletin of Botany, 2006, 23(2): 138-144. 王艷, 唐海溶. 硝酸鹽對球形棕囊藻生長和硝酸還原酶活性的影響. 植物學通報, 2006, 23(2): 138-144.

[34] Ma S J, Wang W Q. The expression ofSQS1 gene and the content of glycyrrhizic acid ofGlycyrrhizauralensisFisch.in different concentrations of Mn2+. Acta Pharmaceutica Sinica, 2015, 50(1): 111-117. 馬生軍, 王文全. 不同濃度錳處理對甘草SQS1基因表達及其甘草酸含量影響的分析. 藥學學報, 2015, 50(1): 111-117.

Effects of inorganic salts on the growth and total flavonoid content ofGlycyrrhizauralensiscallus

LIU Fu-Zhi*， YANG Xiu-Yan

CollegeofAgriculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

In this study, five kinds of inorganic salts were added to Murashige and Skoog (MS) culture medium to determine their effects on the growth rate, physiological indexes, and secondary metabolite contents of licorice (Glycyrrhizauralensis) callus. The hypocotyledonary axis of sterile licorice seedlings was used as the experimental material. The culture medium consisted of MS+6-benyzlaminopurine (0.5 mg/L)+2,4-dichlorophenoxyacetic acid (0.5 mg/L)+naphthalene acetic acid (0.5 mg/L)+kinetin (0.4 mg/L)+agar (8 g/L)+sugar (30 g/L). Tissue culture and ultraviolet spectrophotometry methods were used to study the effects of inorganic salts at various concentrations in the culture medium on the growth and characteristics of licorice callus. Increasing amounts of KNO3and MnSO4·4H2O in the medium increased the biomass of licorice callus. Increasing concentrations of CaCl2·2H2O in the medium led to increased accumulation of soluble sugars and total flavonoids. The highest peroxidase activity was in callus in medium containing 2533 mg/L KNO3. Callus growth and total flavonoid content increased significantly as the KH2PO4concentration increased from 170 mg/L to 226 mg/L. The presence of MgSO4·7H2O in the MS medium promoted licorice callus growth and flavonoid synthesis. However, callus growth and total flavonoid synthesis were affected by the interactions among various inorganic salts. The results of an orthogonal test and range analysis indicated that the optimal combination of salts for growth and secondary product accumulation in licorice callus was as follows: MgSO4·7H2O 493 mg/L; MnSO4·4H2O 7 mg/L; KNO32533 mg/L; KH2PO4170 mg/L; and CaCl2·2H2O 733 mg/L.Key words:Glycyrrhizauralensis; callus; inorganic salt; secondary metabolites

10.11686/cyxb2016239

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-12；改回日期：2016-08-05

甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1429)資助。

柳福智(1976-)，男，寧夏隆德人，博士。E-mail：lfz_1976@126.com*通信作者Corresponding author.

柳福智, 楊秀艷. 無機鹽對甘草愈傷組織生長及總黃酮含量的影響. 草業學報, 2017, 26(5): 118-126.

LIU Fu-Zhi， YANG Xiu-Yan. Effects of inorganic salts on the growth and total flavonoid content ofGlycyrrhizauralensiscallus. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 118-126.