多點平皿培養法在甲真菌病病原菌分離中的應用

多點平皿培養法在甲真菌病病原菌分離中的應用

陳敏 梁強

目的探討多點平皿培養法在甲真菌病病原菌分離中的應用，為臨床診斷甲真菌病原菌提供參考依據。方法選取廣東醫科大學附屬醫院皮膚科門診就診的甲真菌病患者100例作為研究對象。收集病變甲屑標本124例進行甲真菌病原菌分離與鑒定，根據分離方法的不同分為觀察組采用多點平皿培養法，對照組采用常規試管培養法，比較分析不同培養方法病原菌分離的陽性率、病原菌種類的構成以及其污染率。結果觀察組124例甲屑標本，陽性84例（67．7%），污染16例（12．9%）；對照組124例甲屑標本，陽性61例（49．2%），污染5例（4．0%），組間對比，差異均具有統計學意義（P＜0．05）；觀察組和對照組致病菌分離鑒定結果顯示，皮膚癬菌分別為51．19%、70．49%、酵母菌分別為35．71%、19．67%、霉菌分別為2．38%、0．00%。觀察組和對照組分別檢出混合感染9例、6例，差異無統計學意義（P＞0．05）。結論甲真菌病原菌分離中采用多點平皿培養法，具有較高的陽性率，較常規試管培養法能提高病原菌的檢出率。

甲真菌??；診斷；真菌培養；多點平皿培養

甲真菌?。╫nychomycosis）是臨床最為常見的慢性淺部真菌病，造成該病發作的機制是在皮膚癬菌、酵母菌等絲狀真菌作用下導致的具有傳染能力的疾病[1-2]。醫學將其分為原發性和繼發性真菌感染兩類，前者在極大程度上影響了全人類的身體健康，占真菌皮膚感染患者的三分之一，并對患者正常日常生活、工作行為能力造成了極大制約[3]。而要想有效科學的治療該類疾病，首要的是能夠對該病有精準的診斷[4]。當前主要診斷方式是在顯微鏡的幫助下，對患者絲狀真菌或孢子進行觀察，但此方法無法準確判斷致病真菌類型，進而無法制定消除致病真菌方式[5-6]。本文以我院100例甲真菌病患者的124例甲屑標本作為研究樣本，進行多點平皿培養和常規試管培養，并比較其在甲真菌病原菌分離中的應用價值。

1 研究對象

選取2015年6月—2016年6月廣東醫科大學附屬醫院皮膚科門診診治的甲真菌患者100例為研究對象，收集病變甲屑標本124例進行甲真菌病原菌分離與鑒定，所有標本均采用多點平皿培養法和常規試管培養法，觀察組為多點平皿法，對照組為常規試管培養法。所選100例患者中，男54例、女46例，年齡6～78歲，病變部位有指甲真菌病9例、趾甲真菌病68例、指甲和趾甲混合感染者23例；共124例甲屑標本。所選患者均確診為甲真菌病，具有典型的甲真菌病臨床表現，如甲顏色或形態發生改變，甲板明顯增厚、表面可見明顯白班形成，甲下堆積有碎屑等，行甲屑直接鏡檢發現菌絲或孢子。排除慢性濕疹、銀屑病等其他疾病引起的甲改變，免疫缺陷性疾病或近3個月內口服抗真菌藥物以及近1個月外用過抗真菌藥物患者。

2 研究方法

2.1 標本收集

每個患者均選擇其最嚴重的病甲作為取材指（趾）甲，取患甲的碎屑，先進行嚴格消毒，遵守無菌原則以刀片進行刮取。根據病甲的類型，采取不同的取材方法。遠端側位甲下型：伸入遠端甲板內側，刀口朝上刮取甲床甲屑；白色淺表型：取甲板表面甲屑；近端甲下型：先削去正常甲板，再從近端甲床取材；全甲營養不良型：取整甲表面甲屑。

2.2 培養基

培養基可選擇玉米粉吐溫瓊脂培養基、米粉小培養基以及毛癬菌營養瓊脂培養基

2.3 分離培養方法

2.3.1 常規試管真菌培養 取加入培養基的試管，在無菌操作臺內取碎屑標本接種于斜面培養基，放置培養。

結果判定：培養基中的培養點細菌鑒定，有一個以上鑒定出皮膚癬菌，即為培養出致病菌。若不是皮膚癬菌，則連續培養3次，結果為同一病原菌則判定為致病菌，否則判定為污染菌。

2.3 兩組心率變異性和心率減速力指標分析 研究組SDNN、SDANN、RMSSD、LF、HF及心率減速力水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.3.2 多點平皿法真菌培養 取平皿培養基，選擇培養基邊緣呈圓形的10個點進行接種培養。

結果判定：培養基中的培養點細菌鑒定，有1個以上鑒定出皮膚癬菌，即為培養出致病菌；培養的病原菌若為酵母菌或霉菌，若同時有4個以上接種點鑒定為同菌種，則判定為致病菌，反之若無4個以上接種點鑒定為同菌種，則判定為污染菌；培養的病原菌若鑒定為兩種，則判定為混合感染。

2.4 菌種鑒定

培養4周，未發現菌落，則判定為陰性。

鑒定菌種主要根據培養的菌落特征，以及鏡下細菌的形態，其中酵母菌鑒定，需采用科瑪嘉念珠菌顯色培養基與API進一步鑒定明確。

2.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析處理，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

觀察組124例甲屑標本，陽性84例（67.7%），污染16例（12.9%）；對照組124例甲屑標本，陽性61例（49.2%），污染5例（4.0%），兩組陽性率、污染率比較，差異均具有統計學意義（χ2=23.64，P＜0.05；χ2=16.48，P＜0.05）；且觀察組檢出混合感染9例（10.71%），對照組檢出6例（9.83%），兩種檢測方法在單一感染和混合感染的檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

3.2 兩組培養方法三種致病菌構成比較

病原菌菌分離結果顯示，多點平皿三種致病菌構成比，組間對比，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3.3 多點平皿培養法結果分析

選取124例甲碎屑標本，經多點平皿培養共發現84株致病菌，其中有29株取材自指甲標本，55株取材自趾甲標本。指甲標本中三類菌種種類分別為皮膚癬菌24株、酵母菌5株和霉菌0株，而在趾甲標本中分別為48株、6株和1株，兩組菌種比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。本文12例手足甲真菌病患者同時從指甲和趾甲中分離出致病菌，具體為紅色毛癬菌9例、指（趾）間毛癬菌2例、酵母菌1例。多點平皿培養法檢出16例混合感染，均為紅色毛癬菌混合其他菌種感染，其中并發指（趾）間毛癬菌感染7例，并發酵母菌8例，并發霉菌1例。

表1 兩組培養方法分離結果分析（n）

表2 兩組培養方法三種致病菌構成比較（n）

表3 多點平皿培養法對指甲和趾甲病原體陽性率與污染率比較 [n（%）]

另外，多點平皿培養的84株致病菌，29株指甲標本，55株趾甲標本，分析不同來源標本陽性率和污染率，結果顯示趾甲標本的陽性率高于指甲標本，但兩種標本的污染率對比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

4 討論

隨著醫學研究的深入，皮膚癬菌、酵母菌還有絲狀真菌引發該病發作的認識已經深入人心，因此該病稱為“甲真菌病”。但因該病而分離出的酵母菌、霉菌到底是導致該病發作的機制，還是該病的并發癥，醫學界仍然存在極大爭議[7]。且該病具有較強的傳染能力，可影響全人類的身體健康和生存狀態，因而受到世界衛生組織的極大重視。

當前該病的診斷主要是通過臨床診斷、KOH直接鏡檢等方式來實現，但因為器材等原因的限制，經常診斷出假陰性，而陽性占50%～70%。一般而言，醫護人員可以通過真菌真正來判斷皮膚癬菌類型，對無特征顯現的真菌可以通過鏡檢檢查、察氏培養基等來識別曲菌和青霉，PDA培養基也能起到區分毛菌、暗色孢科真菌等不同種屬真菌。但通過培養基來鑒定真菌，常常會因為皮膚癬菌、絲狀真菌或者酵母菌的感染，而無法區分其是否是致病真菌，造成鑒定結果難以讓人信服的情況[8-9]。

總的來說，過去醫學界采用的診斷、鑒定方式，主要有這樣幾個問題：（1）檢查出致病真菌的幾率較低；（2）對非皮膚癬菌的致病真菌很難鑒定，難以判斷酵母菌、霉菌到底是致病真菌還是培養基污染菌。（3）對混合感染也難以進行鑒別[10-11]。

早在上世紀七十年代，Walshe、English等相關專家就指出，可以通過推算標本培養中生成的非皮膚癬菌菌落數量，來判定是否為非皮膚癬菌甲真菌病。近幾年來，相關專業人士提出并進行了多點平皿接種真菌培養方法，來完成甲真菌病的診斷工作。當前，國內很多醫院也都采用此方式來完成甲真菌的診斷，但直到目前，醫學界仍未對此種診斷方式有統一的論斷[12]。

本文采用多點平皿接種培養真菌和試管點植培養真菌兩種不同的培養方法，培養甲真菌病致病真菌，并將其具體的診斷情況進行比較，發現多點接種培養法陽性率高于傳統點植培養法，差異有統計學意義（P＜0.05）。這是因為多點接種法真菌培養，等同于同時展開真菌培養，從而加大了致病真菌被發現的幾率，極大程度上減少了假陰性的幾率。通過對比兩方式分離出的皮膚癬菌、酵母菌，兩種方式呈現出明顯的差異（P=0.001），通過多點接種法培養出來的真菌數量，遠遠超過了常規試管點植真菌培養方法。由此可見，在甲真菌病的培養分離上，多點平皿培養法更加適用，尤其是對于非皮膚癬菌的分離。理論上來說，多點接種法能夠避免污染菌以及混合感染造成的不利影響，而且生長速度較慢的皮膚癬菌，很難被長成速度較快的霉菌所吞噬，也就極大提升了皮膚癬菌被診斷出來的幾率[13]。這是由于多點接種法真菌培養引發非皮膚癬菌機制不清導致的，可以結合甲真菌病致病機制來證實。假如得出的結果和甲真菌病致病原理相同，則證判定標準是準確的；相反，則說明此類方法對非皮膚癬菌致病機制判斷仍然缺乏精確性，需要進一步的研究。所以，當前對多點接種培養法診斷非皮膚癬菌致病機制的判斷仍然需要更為深入的研究[14]。

混合感染在甲真菌病患者群體中有不小的比例，但醫學界對混合感染的診斷方式仍然未能達成統一的見解，特別是當接種點分離既分離皮膚癬菌又分離出霉菌，如此是真菌混合感染還是污染及感染難以區分開來。本次研究中，兩種方法均檢出混合感染，多點培養法檢出混合感染9例（10.71%），常規培養法檢出6例（9.83%），兩種檢測方法在單一感染和混合感染的檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。黃懷球等[15]研究通過多點接種法真菌培養診斷出2例混合感染，而通過點植培養法卻未能檢查出混合感染。而在實驗組患者群體中，卻發現了很多混合感染的患者，結果證明多點接種法更加有利于混合感染的診斷。本文與其研究結果不一致，考慮為未能檢查出更多的病例，未能體現出較為明顯的統計學差異，亟待更為深入的研究工作。以上證明，多點接種法能夠提升家真菌病的診斷。

本文所取124例標本，分別采用多點平皿培養和試管培養兩種培養方法，培養分離菌種，實驗證明多點培養方式陽性率更高，能夠分離更多病菌，而且發現酵母菌的幾率也大大提升。這是因為多點培養法能夠同時采集較多甲屑、有較多接種點數以及菌落容易發現區分等原因。此外，還能在極大程度上減少大菌落對小菌落病菌的遮掩情況。雖然多項研究明確多點培養法在發現、鑒定酵母菌中的優勢，但在臨床上，卻缺乏足夠的認識和推廣。這是因為該方法也存在易于污染、能夠提升高假陽性等問題，所以科學操作、準確取材以及提升高培養準確率是當前醫學研究的重點，只要改進這些缺陷，此類診斷方式才能在臨床上獲得更為廣泛的應用。

[1] Kollef MH． Prevention of hospital-associated pneumoniaand ventilator－associated pneumonia[J]． Crit Care Med，2004，32（7）：1396-1405．

[2] Grover C，Khurana A． An update on treatment of onychomycosis[J]．Mycoses，2012，55（6）：543-551．

[3] 佟盼琢，田珂，康美玉，等． 甲真菌病患者生活質量及口服伊曲康唑間歇沖擊療法對其的影響[J]． 中國真菌學雜志，2009，4（4）：221-224．

[4] 潘煒華．2015年版中國甲真菌病診療指南解讀[J/OL]．世界臨床藥物，2016，37（2）：73-76．

[5] 王愛平，余進，萬喆，等． 國內多中心甲真菌病病原菌流行病學調查[J]． 中國真菌學雜志，2015，10（4）：197-202．

[6] 尹頌超，張云青，譚永芳，等．805例甲真菌病真菌培養結果分析[J]．中國真菌學雜志，2013，8（4）：214-216．

[7] Bruisten SM，Cairo I，Fennema H，et al． Diagnosing genital ulcer disease in a clinic for sexually transmitted disaese in Amsterdam, the netherlands[J]． J Clin Micro biol，2001，39（2）：601-605．

[8] 馬國群，戴唯． 761例甲真菌病病原菌分離培養分析[J]． 中華醫院感染學雜志，2011，21（3）：617-618．

[9] 謝倩，劉恩讓，劉麗，等． 260例甲真菌病病原菌的分離培養[J]．吉林醫學，2011，32（20）：4084-4085．

[10] 李正． 廈門地區淺部真菌病5833例病種及病原菌分析[D]． 合肥：安徽醫科大學，2015：1-39

[11] 田珂，佟盼琢，趙如同，等． 對石家莊地區316例甲真菌病病原菌的鑒定與分析[J]．現代中西醫結合雜志，2008，17（21）：3274．

[12] 王愛平，余進，萬喆，等． 國內多中心甲真菌病病原菌流行病學調查[J]． 中國真菌學雜志，2015，10（4）：197-202．

[13] 徐明，張弘，陳靜． 505例甲真菌病真菌培養結果分析[J]． 福建醫藥雜志，2009，31（1）：102-103．

[14] 郭秀軍，吳立新，李屹，等． 某社區醫院甲真菌病臨床類型和致病真菌的研究[J]．中國皮膚性病學雜志，2008，22（7）：406-408．

[15] 黃懷球，賴維，張玉清，等． 多點接種真菌培養法在甲真菌病病原學診斷中的應用研究[J]． 中國皮膚性病學雜志，2005，19（9）：525-526，532．

Multiple Spots Inoculation of Fungi in Sabouraud Agar for the Diagnosis of Onychomycosis

CHEN Min LIANG Qiang Pathogen Biology Laboratory Basic Medical College of Guangdong Medical University, Dongguan Guangdong 523808, China

ObjectiveTo explore the application of multi-point plate culture in the isolation of onychomycosis pathogens.Methods124 cases of pathological specimens of the lesions were collected for the isolation and identi fi cation of fungal pathogens. The observation group was treated with multi-point plate culture method, while the control group was treated with conventional tube culture method.ResultsThe observation group of 124 cases of a chip were positive in 84 cases (67.7%), 16 cases of pollution (12.9%); 124 cases in the control group a crumb specimens, 61 were positive (49.2%), 5 cases of pollution (4.0%), the comparison between the two groups, the differences were statistically significant (P＜ 0.05); the observation group and the control group the pathogen identificationresults showed that dermatophytes were 51.19%, 70.49%, 35.71%, 19.67% respectively, yeast and mold were 2.38%, 0.00%. In the observation group and the control group, 9, 6 cases of mixed infection were detected, and there were no signi fi cant difference betweentwo groups (P＞ 0.05).ConclusionThe method of multi-point plate culture in the isolation of onychomycosis fungi has a higher positive rate, which can improve the detection rate of pathogenic bacteria compared with the conventional culture method.

onychomycosis; diagnosis; fungal culture; multi-point plate culture

R446．5

A

1674-9316（2017）09-0007-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．09．004

廣東醫科大學基礎醫學院病原生物學實驗室，廣東 東莞523808