利用DNA條形碼對10種蒼耳屬雜草的鑒定

袁俊杰+馬新華+龍+陽+魏霜+張娜+陳文+楊卓瑜

摘要：使用ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK等序列對截獲的10種蒼耳屬（Xanthium）雜草進行擴增測序，比較各序列的擴增和測序效率，采用最近距離法和相似性搜索算法評價不同序列的鑒定效率。采用最佳鑒定序列計算種間K2P距離并構建系統進化樹。結果表明，ITS、psbA-trnH 2個序列的擴增效率和鑒定效率最高；ITS序列的種間變異最大，其次是psbA-trnH序列，matK序列的種間變異最小；ITS序列的Neighbor-Joining（NJ）樹可明顯地將不同蒼耳屬雜草種分開；psbA-trnH序列可明顯地將國內蒼耳種和檢疫性蒼耳種分開。說明利用DNA條形碼能夠準確地鑒別蒼耳屬雜草，ITS和psbA-trnH序列是鑒別蒼耳屬雜草較理想的條形碼組合。該研究結果為蒼耳屬雜草的分子鑒別提供了科學依據與新的思路。

關鍵詞：psbA-trnH；ITS；DNA條形碼；蒼耳屬；雜草鑒定

中圖分類號：S451 文獻標志碼：A 文章編號：1003-935X（2016）03-0011-06

Identification of Ten Xanthium weeds Using DNA Barcoding Sequences

YUAN Junjie1，MA Xinhua1，LONG Yang1，WEI Shuang2，ZHANG Na1，CHEN Wen1，YANG Zhuoyu1

（1.Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang 524022，China；

2.Shantou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou 515000，China）

Abstract：DNA from ten weed species of the genus Xanthium was amplified and sequenced using five candidate sequences （ITS＼ITS2＼psbA-trnH＼rbcL and matK）. The PCR amplification and sequencing efficiencies were compared and the identification efficiency was assessed using BLAST1 and Distance methods. The best identification of sequence was analyzed and the NJ tree was constructed. The amplification and sequencing efficiencies of ITS，psbA-trnH were the best. ITS showed the largest interspecific variation，followed by psbA-trnH sequence； matK was the worst. The ten species of Xanthium weeds could be distinguished by ITS2 region using inter-specific K2P genetic distance and NJ tree. Quarantine and common Xanthium plants could be distinguished by psbA-trnH region. Using DNA barcode can accurately identify ten species of Xanthium weeds. ITS2 and psbA-trnH could be used as a potential DNA barcode combination to correctly identify the Xanthium weeds. The research provides scientific basis and new ideas for the molecular identification of Xanthium weeds.

Key words：psbA-trnH；ITS；DNA barcode；Xanthium；weed identification

蒼耳屬（Xanthium）為雙子葉綱菊科植物，全球約有25種[1]，蒼耳屬（非中國種）雜草為我國禁止進境的植物檢疫性有害生物[2]，其適應性強、競爭力強、繁殖力強，與農作物爭奪生存空間，幼苗具有毒性，且總苞具鉤狀的硬刺，易劃破動物的皮膚，威脅牲畜健康。蒼耳屬雜草危害較大，一直是世界各國重點關注的惡性雜草，在口岸防止蒼耳屬雜草的入侵具有重要意義。然而在進出口貨物中，蒼耳屬雜草一般以籽實的形態混雜于糧谷類產品及其包裝物中，種類繁多，近似種相似性較高，鑒定困難；且蒼耳屬雜草籽在運輸過程中總苞表面堅硬的刺以及密布的柔毛等重要鑒定特征會發生較大磨損，這就給形態學鑒定帶來很大的難度[3-4]。因此，建立穩定且準確的分子生物學分類方法作為形態學鑒定的補充方法具有重要意義。

DNA條形碼（DNA barcoding）由加拿大動物學家Hebert 等首次提出[5]，具有不受個體形態特征限制、不受個體發育階段影響、從基因水平上客觀區分物種、操作方法相對簡便等特點[6-10]，是近十幾年來研究進展最迅速的學科之一[11]，其通用序列的篩選一直是該領域研究的熱點問題。2009年，生命條形碼聯盟植物工作組（the plant working group of the consortium for the barcode of life，CBOL）分析了550個物種907個樣品后，推薦以復合序列rbcL+matK作為整個植物界的DNA條形碼序列，但其在物種水平的鑒定成功率僅為72%[12]，所以仍在進行驗證和新序列的研究工作。

目前DNA條形碼在植物類群中的研究和應用還處于起步階段。理想的條形碼序列在單一科屬內大量近緣物種鑒別時應具備準確性和高效性，同時在大量科屬間進行物種鑒別時應該具有通用性。盡管已有學者在近緣屬、種中開展植物條形碼的研究工作[13-16]，但在被考察序列受關注程度、樣本的數目、取樣密度及代表性、候選序列的評價指標等方面存在一定的局限性。學者們推薦了幾種植物的DNA條形碼候選序列及其組合[17-19]，但這些序列是否適合每一個具體的植物科或屬，尚需進行針對性的探索研究。在此背景下，本研究選取近年來幾個重點推薦的序列，如ITS、ITS2、rbcL、matK以及psbA-trnH，比較其對蒼耳屬雜草種類的鑒別能力，考察各候選序列作為該屬雜草DNA條形碼通用序列的適用性，以期為DNA條形碼技術在蒼耳屬雜草籽鑒定中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用蒼耳屬雜草籽從近5年的進境糧谷（美國黃大豆、巴西黃大豆、烏克蘭玉米、澳大利亞油菜籽、加拿大油菜籽、美國高粱等）中截獲（表1）。經中國檢驗檢疫科學研究院鑒定，憑證標本保存于湛江出入境檢驗檢疫局。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改良后的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒法提取DNA，參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 PCR擴增和電泳檢測 PCR反應使用寶生物工程（大連）有限公司rTaq酶進行擴增，反應采用50 μL體系：3 μL DNA模板，5 μL 10×PCR Buffer，4 μL dNTPs，0.25 μL rTaq，各1 μ上、下游引物（表2），補充ddH2O至50 μL。ITS、ITS2、rbcL采用相同的PCR條件：95 ℃、4 min；94 ℃、30 s，52 ℃、45 s，72 ℃、45 s，35個循環；72 ℃、10 min。matK的PCR條件：95 ℃、4 min；94 ℃、45 s，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1.5 min，35個循環；72 ℃、10 min。psbA-trnH的PCR條件：95 ℃、4 min；94 ℃、30 s，52 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃、10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統進行分析。

使用ABI3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.，USA）直接對PCR產物進行雙向測序。利用序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.7.1對測序峰圖文件進行拼接，去除引物區及低質量序列。使用Clustal（MEGA 5.0）軟件對拼接后的序列進行比對分析。運用相似性搜索算法（BLAST1）和最近距離法（K2P nearest distance）考察各序列的鑒定成功率。整合處理后結合樣品序列，并運用MEGA 5.0建立Neighbor Joining（NJ）樹，分析蒼耳屬各樣本的親緣關系。

2 結果與討論

2.1 序列信息及鑒定成功率

從表3可以看出，5條片段的 PCR 擴增效率和測序效率均較高，除matK的擴增效率為56.0%，測序效率為88%外，其他片段的擴增和測序效率均高于90%，其中ITS、ITS2、psbA-trnH擴增和測序效率均高于95%。片段長度方面，ITS2 的長度最短，為 494～498 bp；其次是 psbA-trnH，為 521～543 bp；rbcL 和 ITS 較長，分別為 720 bp 和 720～727 bp；matK最長，為844 bp。各片段的 GC 量以psbA-trnH的最低，為 26.5%～26.9%；ITS2的最高，為 548%～56.4%。psbA-trnH與ITS序列均有53個變異位點，其次為ITS2，包含26個變異位點，matK和 rbcL 分別有7、3個變異位點。psbA-trnH有22 bp的插入/缺失，為5個序列中最多的。

2.2 鑒定效率分析

采用Distance 和BLAST1方法分析不同DNA條形碼序列對10種蒼耳屬雜草籽的鑒定效果，結果如表4所示，應用ITS序列2種方法的鑒定成功率均最高，分別為94%、99%；其次是psbA-trnH，鑒定成功率分別為 92%、89%；ITS2稍差于 psbA-trnH，鑒定成功率為 91%、86%；而rbcL和matK的鑒定效率較低，2種方法的成功率均不足40%。

2.3 10種檢疫性蒼耳屬雜草的psbA-trnH和ITS序列分析

2.3.1 K2P遺傳距離 同一地區樣本個體之間序列完全相同，種內K2P遺傳距離為0。利用 MEGA 7.0 軟件，采用 Kimura 2-parameter model模型計算種間遺傳距離（表4），蒼耳屬植物ITS序列的遺傳距離最高值為 0.068 0，是蒼耳與沃式蒼耳的遺傳距離；最小值為 0.000 0，是河岸蒼耳與賓州蒼耳，意大利蒼耳與球果蒼耳，西方蒼耳與意大利蒼耳、球果蒼耳的遺傳距離。這說明國內蒼耳與各檢疫蒼耳之間存在較大的遺傳距離，存在較大的遺傳差異；河岸蒼耳與賓州蒼耳，意大利蒼耳與球果蒼耳，西方蒼耳與意大利蒼耳、球果蒼耳之間遺傳距離為0，不存在遺傳差異。

同一地區樣本個體之間序列完全相同，種內K2P遺傳距離為0。利用 MEGA 7.0 軟件，采用Kimura 2-parameter model模型計算種間遺傳距離（表5），蒼耳屬植物 psbA-trnH 序列的遺傳距離最高值為0.093 5，是刺蒼耳與柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳的遺傳距離；最小值為 0.000 0，是北美蒼耳與球果蒼耳、賓州蒼耳、西方蒼耳、沃式蒼耳之間及柱果蒼耳與意大利蒼耳、河岸蒼耳之間的遺傳距離。這說明北美蒼耳與球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳之間不存在遺傳差異。

2.3.2 Neighbor-Joining（NJ）樹 利用 MEGA 70 軟件，采用 Neighbor-Joining 方法構建系統發育樹。基于 ITS 序列（圖1），蒼耳、刺蒼耳被分為一支，并且存在遺傳距離，各自成一支；賓州蒼耳、河岸蒼耳被分為一支；柱果蒼耳獨成一支；意大利蒼耳、球果蒼耳、西方蒼耳被分為一大支；北美蒼耳、沃式蒼耳各自獨成一支；從 NJ 樹圖可以看出，10種蒼耳屬雜草均可以互相區分，可直觀地展現不同序列的物種鑒別情況。

基于psbA-trnH序列（圖2），蒼耳、刺蒼耳被分為一支；柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳被分為一支；北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳被分為一支；對其進行 Bootstrap檢驗，其分組支持率為100%，說明這3支蒼耳屬雜草在系統進化發育中是相互獨立的。柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳又被劃分為不同級別的3個分支，但其Bootstrap檢驗支持率較低，說明這3種蒼耳屬雜草獨立性相對較弱。北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳也被分為各自獨立的分支，但其Bootstrap檢驗支持率較低，說明這5種蒼耳屬植物獨立性相對較弱。

由以上數據可以得出，ITS序列構建的NJ樹

可以對10種蒼耳屬雜草籽進行區分，相對于psbA-trnH 序列的區分度更高，更加適用于蒼耳屬雜草的鑒別。

3 討論

本研究比較分析了ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK等5條DNA條形碼序列對10種蒼耳屬雜草籽的鑒別情況。綜合比較可以看出，ITS、ITS2、psbA-trnH序列的鑒定效率較高，遺傳距離較大，鑒定成功率較高，較適合作為鑒別蒼耳屬雜草籽的條形碼序列。

蒼耳屬是菊科的一個大屬，種類繁多，其非我國種均為我國禁止進境的植物檢疫性有害生物，危害性極大。由于同屬雜草種外部形態極其相近，在口岸檢疫時易誤鑒定為國內種而引入。DNA 條形碼是依靠 DNA 片段上承載的序列信息的不同，對物種進行快速、準確鑒定的新方法，在本研究中國際DNA條形碼鑒定聯盟組織CBOL推薦的rbcL、matK序列均較保守，序列種內種間的重疊較大，兩者均不適用于10種蒼耳屬雜草籽的鑒定。psbA-trnH是進化速率較快的基因間隔區之一，兩端具有較為保守的psbA和trnH，該序列的顯著特點是存在較多的插入/缺失，用psbA-trnH序列上的信息位點成功鑒定了國內蒼耳與國外蒼耳籽，但無法有效區分國外蒼耳籽。本研究中北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳有22個堿基的缺失，其他蒼耳屬植物均無。在此情況下，采用ITS、ITS2序列進行補充研究，ITS和ITS2 是位于nrITS 序列上5.8S～26S 核糖體 DNA 的內轉錄間隔區，具備了 5.8S和26S兩端的保守區設計通用引物，該序列最早被應用于系統發育和物種的分類研究中[20-22]，包含豐富的變異位點和信息位點，可以用于對物種進行鑒定。研究發現，10種蒼耳屬雜草籽psbA-trnH 的種間變異、鑒定成功率均與ITS2序列持平，但均小于ITS序列。本研究中ITS在10種蒼耳屬雜草籽的PCR擴增效率和測序成功率均高于95%，基于BLAST1和 Distance 方法的鑒定效率達到90%以上，通過分析10種蒼耳屬雜草籽ITS種間 K2P 遺傳距離和NJ樹可以看出，ITS序列均可準確鑒定蒼耳等10種蒼耳屬雜草籽。

結果表明，采用ITS序列鑒定中，國內蒼耳僅與刺蒼耳遺傳距離較近，區分度較低，但國內蒼耳與其他檢疫性蒼耳均具有顯著區別，可以通過ITS序列進行鑒定區分，且區分度較高；NJ樹分析均可將各物種區分開來，且差異顯著。psbA-trnH序列也能同時單獨鑒定出10種蒼耳屬雜草籽，能明顯區分出國內蒼耳與檢疫性蒼耳，但各檢疫蒼耳區分度較低。兩者在鑒定能力上可互為補充，組合鑒定可以得出一個更為準確的鑒定結論。綜上所述，采用ITS和psbA-trnH可以作為組合DNA條形碼應用于蒼耳屬雜草籽的檢疫工作當中。

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