新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂蔗糖反應行為的影響

李 夢 和靜芳 李志國 蘇松坤

（福建農林大學蜂學學院，福州350002）

新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂蔗糖反應行為的影響

李 夢 和靜芳 李志國 蘇松坤

（福建農林大學蜂學學院，福州350002）

新煙堿類殺蟲劑（neonicotinoid insecticide）目前已經成為全球范圍內應用最廣泛的一類殺蟲劑。此類殺蟲劑通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，釋放乙酰膽堿受體抑制劑，阻礙昆蟲神經傳導，影響昆蟲正常生理行為，最終導致昆蟲麻痹死亡[1]。本文通過測定吡蟲啉與噻蟲胺兩種新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂（Apis cerana cerana）24 h內半數致死劑量（median lethal dose，LD50）[2]，評估此類殺蟲劑對中華蜜蜂的急性致死毒性。并通過統計經過亞致死劑量（sub-lethal dose）處理的中華蜜蜂，經過2 h、24 h和48 h后的伸吻反應率，從而進一步探究新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂行為的影響。

中華蜜蜂；新煙堿類殺蟲劑；吡蟲啉；噻蟲胺；伸吻反應

1 研究背景

新煙堿類殺蟲劑是一類新興的農藥，具有高效率、高選擇性、高持效性、對哺乳動物低毒等特點，被廣泛應用于農業生產中。新煙堿類殺蟲劑包括吡蟲啉（imidacloprid）、啶蟲脒（acetamiprid）、噻蟲胺（clothianidin）、噻蟲嗪（thiamethoxam）、噻蟲啉（thiacloprid）、呋蟲胺（dinotefuran）及烯啶蟲胺（nitenpyram）。這類殺蟲劑在田間的大量使用，不僅可以有效防控有害昆蟲，對于不屬靶標的授粉類昆蟲也有一定危害[3,4]。蜜蜂作為社會性昆蟲的模式生物，在采蜜和采粉的過程中，會接觸到暴露在空氣中或者植物表面的殘留殺蟲劑，進而影響蜜蜂的行為、營養物質代謝及免疫系統[5]。關于新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂影響的報道多集中在西方蜜蜂，對于中華蜜蜂影響的研究甚少。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

福建農林大學蜂學學院中華蜜蜂實驗蜂群3群，飼養盒，飼喂器，蔗糖，吡蟲啉（Sigma，2016），噻蟲胺（Sigma，2016），丙酮，膠帶，離心管。

2.2 實驗方法

2.2.1 農藥的制備

將吡蟲啉和噻蟲胺分別溶解于丙酮中，配制成500ng/μl的母液。將母液溶解于30%的糖水中，分別配制成含有吡蟲啉和噻蟲胺的糖水。

吡蟲啉的濃度分別為：0.5 ng/μl，1.0 ng/μl，1.5 ng/ μl，2.0 ng/μl，2.5 ng/μl，丙酮對照組濃度分別為：0.001 ng/μl，0.002 ng/μl，0.003 ng/μl，0.004 ng/μl，0.005 ng/ μl；噻蟲胺的濃度分別為：0.1 ng/μl，0.2 ng/μl，0.3 ng/ μl，0.4 ng/μl，0.5 ng/μl，丙酮對照組濃度分別為：0.0002 ng/μl，0.0004 ng/μl，0.0006 ng/μl，0.0008 ng/μl，0.001 ng/μl。

2.2.2 LD50的測定

在3個實驗蜂群中分別收集100只中華蜜蜂，經冷凍麻醉后，每只蜜蜂飼喂2 μl含有農藥的糖水，每個濃度飼喂20只，分別放入飼養盒中恢復（對照組與處理組處理方法相同，每個蜂群重復三次）。然后，將飼喂器中裝入足夠量的30%的糖水插入飼養盒。將飼養盒放入恒溫恒濕箱（30℃,RH:70%）培養24 h后，統計蜜蜂死亡數量，計算死亡率。

2.2.3 亞致死劑量的確定

分別用吡蟲啉和噻蟲胺對中華蜜蜂24 h內LD50/ 2，LD50/5，LD50/10的劑量飼喂中華蜜蜂（方法同2.2.2），24 h后統計死亡數量，并計算死亡率。

2.2.4 梯度PER

圖1 蜜蜂捆綁方法

圖2 蜜蜂飼喂方法

在實驗蜂群中收集若干只蜜蜂，經冷凍麻醉后，用膠帶將蜜蜂固定在準備好的離心管中（只允許蜜蜂的頭和觸角活動，圖1、2），放入恒溫恒濕箱恢復2 h。然后，處理組每只蜜蜂飼喂含有亞致死劑量殺蟲劑的糖水，對照組每只蜜蜂飼喂含有與處理組相同質量丙酮的糖水，放入恒溫恒濕箱中培養。分別在2 h，24 h和48 h后統計每只蜜蜂對0.1%，0.3%，1%，3%，10%和30%濃度糖水的伸吻反應情況，并計算伸吻反應率（圖3）。

3 數據分析

3.1 LD50的測定

通過統計經過處理的蜜蜂24 h后的數量，用SPSS軟件進行數據分析得出，吡蟲啉與噻蟲胺對中華蜜蜂24 h內LD50分別為1.942 ng/bee和0.557 ng/bee。

圖3 吡蟲啉與噻蟲胺對中華蜜蜂伸吻反應率的影響（*代表差異性顯著，0.01＜p＜0.05；**代表差異性極顯著，p＜0.01)

3.2 亞致死劑量的確定

通過統計經過亞致死劑量處理的蜜蜂的死亡數量與對照組比較，發現LD50/2處理組經過24 h和48 h后與對照組死亡率都無顯著性差異。因此，將LD50/2作為處理蜜蜂的亞致死劑量。

4 結果與討論

通過新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂24 h內LD50的數據分析，噻蟲胺的毒性明顯大于吡蟲啉，說明第二代新煙堿類殺蟲劑對于蜜蜂等授粉昆蟲毒性更大，藥效時間更長。但通過對西方蜜蜂LD50測定的實驗中看出，不同的實驗中測得LD50不盡相同，這可能是由于實驗條件如氣候、溫濕度、測定方法等因素及世界范圍內蜜蜂遺傳背景的差異，而造成新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂急性致死劑量的差異性。

通過PER實驗數據可以看出，經過吡蟲啉處理的中華蜜蜂，2 h后，處理組對0.3%，1%和3%三個濃度的糖水反應率比對照組高，但差異不顯著。其它經過處理的蜜蜂與對照組相比，伸吻反應率都有不同程度的下降。其中吡蟲啉處理組與噻蟲胺處理組經過24 h后，其伸吻反應率與對照組相比明顯下降，并表現出差異極顯著。

根據文獻報道，吡蟲啉在進入昆蟲體內20 min后，可代謝70%，經過4～5 h后可全部代謝。其中吡蟲啉的五種代謝產物中，有兩種含有與吡蟲啉相同的藥效官能團，繼續作用于昆蟲。但經過36 h后，昆蟲可通過自身免疫機制消耗吡蟲啉的代謝物[6-8]。噻蟲胺作為第二代新煙堿類殺蟲劑，雖與吡蟲啉具有相同的藥效官能團，但其代謝產物中可全部保留能與昆蟲乙酰膽堿受體結合的藥效基團[9]。本文實驗結果證實了這種觀點，經過吡蟲啉處理的蜜蜂，在48 h后，對照組與處理組均表現出差異不顯著。而噻蟲胺處理組經過48 h后與對照組相比，對0.1%，3%，10%和30%濃度的糖水表現出差異極顯著。說明噻蟲胺對于蜜蜂的藥效時間比吡蟲啉長。

隨著新煙堿類殺蟲劑不斷更新換代，其毒性對于蜜蜂來說也逐漸增大。更應引起我們關注的是，在面對含有新煙堿類殺蟲劑的蜜粉源和不含有殺蟲劑的蜜粉源時，蜜蜂更傾向于采集含有殺蟲劑的植物蜜粉源[5]，這就使蜜蜂在采集過程中接觸殺蟲劑的可能性增加，從而影響蜜蜂健康。

中華蜜蜂是我國的特有蜂種，其對殺蟲劑等農藥的抵抗力很低，我們在研究新煙堿類殺蟲劑對中華蜜蜂影響的同時，可進一步揭示其內在的免疫機制和生理防御功能，為今后更好的平衡農業發展與生態環境保護提供理論基礎。

[1]Belzunces L P,Tchamitchian S,Brunet J L.Neural effects of insecticides in the honey bee[J].Apidologie,2012,43(3):348-370.

[2]Medrzycki P,Giffard H,Aupinel P,et al.Standard methods for toxicology research in Apis mellifera[J].Journal of Apicultural Research,2013,52(4):210-220.

[3]Goulson D.Neonicotinoids impact bumblebee colony fitness in the field;a reanalysis of the UK's Food&Environment Research Agency 2012 experiment[J].Peerj,2015,31(2)：390-409.

[4]Garbuzov M,Couvillon M J,Schurch R,et al.Honey bee dance decoding and pollen-load analysis show limited foraging on springflowering oilseed rape,a potential source of neonicotinoid contamination[J].Agr Ecosyst Environ,2015,203:62-68.

[5]Kessler S C,Tiedeken E J,Simcock K L,et al.Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides [J].Nature,2015,521 (7550):74-85.

[6]Suchail S,Debrauwer L,Belzunces L P.Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera[J].Pest Manag Sci,2004,60(3):291-296.

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[8]Casida J E.Neonicotinoid metabolism:compounds,substituents, pathways,enzymes,organisms,and relevance [J].J Agric Food Chem,2011,59(7):2923-2931.

[9]Tomizawa M,Casida J E.Neonicotinoid insecticide toxicology: Mechanisms of selective action[J].Annu Rev Pharmacol,2005,45: 247-268.

The effects of sucrose behavior responses on Apis cerana cerana by neonicotionid insecticides

Li Meng,He Jingfang,Li Zhiguo,Su Songkun

(College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

Neonicotinoid insecticides（neonicotinoids）are now the most widely used insecticides in the world.The neonicotinoid insecticide acts on the nicotinic acetylcholine receptors(nAChRs)of insects,releasing ach receptor inhibitor and preventing the conduction of neuro.Our study measured the LD50in 24 h of the Apis cerana cerana which exposure on the imidacloprid and clothianidin to assess the acute toxicity death of Apis cerana cerana.Then we made the Apis cerana cerana exposure on the insecticides sub-lethal dose,after 2 h、24 h、and 48 h.We collected the data of PER to explain the effect of neonicotinoid insecticides on the Apis cerana’s behaivour.

Apis cerana cerana，neonicotinoid insecticide，imidacloprid，clothianidin;proboscis extension response(PER)

國家現代蜂產業技術體系項目（CARS-45）

李夢（1990-），女，在讀碩士，主要研究方向為新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂健康的影響，E-mail：276360394@qq.com

蘇松坤（1970-)，研究員，博士生導師，主要研究方向為蜜蜂科學，E-mail：365634176@qq.com