脂多糖對大鼠星形膠質細胞Ski蛋白表達的影響①

趙 鑫，郭永強，王 明，陳鐵戈，伍亞民，張海鴻

·基礎研究·

脂多糖對大鼠星形膠質細胞Ski蛋白表達的影響①

趙 鑫1,2，郭永強1,2，王 明1,2，陳鐵戈1,2，伍亞民3，張海鴻1

目的探討內毒素脂多糖對大鼠星形膠質細胞ski蛋白表達規律及胞定位的影響。方法新生3 d內Sprague-Dawley大鼠，取大腦皮質分離星形膠質細胞，體外培養。采用0 μg/ml、0.001 μg/ml、0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml脂多糖誘導6 h；采用0.1 μg/ml脂多糖誘導0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。Western blotting法檢測星形膠質細胞中ski蛋白的表達，間接免疫熒光雙標法檢測ski在星形膠質細胞中的定位。結果0.1 μg/ml脂多糖誘導下，ski蛋白表達最高(F=46.656,P＜0.001)。0.1 μg/ ml脂多糖誘導4 d時最高，6 d時逐漸降低。在無脂多糖誘導及脂多糖誘導6 d時，ski蛋白主要表達于細胞核；脂多糖誘導2 d、4 d時，細胞質中出現ski表達。結論脂多糖可誘導星形膠質細胞ski蛋白表達，可能參與炎癥反應。

ski蛋白；脂多糖；炎癥；星形膠質細胞；大鼠

ski作為進化保守蛋白，最早被發現存在于Sloan-Kettering病毒基因組中，有特異的結構功能[1]。近年來，關于ski在不同系統或組織中的作用及機制研究較多。已有大量文獻報道，ski在脊髓損傷、肝臟再生、多種腫瘤的發生發展、血管平滑肌的增殖及創口愈合等領域發揮重要的調控作用[2]。

星形膠質細胞作為中樞神經系統(central nervous system,CNS)中重要的免疫效應細胞，是脊髓損傷后炎癥因子釋放的主要來源，在CNS病變時被活化而發揮損傷和修復雙重作用[3-5]。在炎癥、損傷的免疫應激反應中，星形膠質細胞發生明顯的活化，并合成和分泌一系列細胞因子參與炎癥反應[6-8]。ski在成纖維細胞中，可以降低炎癥細胞因子的水平，發揮抗炎作用[9]。本研究觀察脂多糖致炎作用下[10]，星形膠質細胞中ski蛋白的表達規律及定位特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

3日齡內Sprague-Dawley大鼠，購于甘肅省中醫藥大學動物實驗中心。

DMEM/F12培養基、胰蛋白酶：GIBCO公司。胎牛血清(FBS)：PAN-BIOTECH GMBH公司。脂多糖、TritionX-100、SDS、小鼠抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體(G3893)：SIGMA公司。RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒：碧云天公司。ski(H-329，sc-9140)：SANTA CRUZ公司。小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體：PROTEINTECH公司。山羊抗小鼠lgG、FITC標記山羊抗兔lgG：SOLARBIO公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或抗小鼠lgG：北京中杉金橋生物技術有限公司。山羊封閉血清、PVDF膜(0.45 μm)：SOLARBIO公司。ECL試劑盒：MILLOPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質細胞的提取、純化及體外培養

大鼠75%酒精浸泡，-20℃冰箱冷凍麻醉5 min。無菌快速取出雙側大腦皮質，放入DMEM/F12液中，漂洗2遍。眼科尖鑷仔細剝離腦膜，置盛有胰酶的皿器中，剪碎腦皮質，用吸管輕柔吹打至組織塊消散。置37℃溫箱充分消化3 min。移至15 ml離心管中，加完全培養液(含12%FBS的DMEM/F12)3 ml，1500 r/min離心8 min。棄上清液，再加入完全培養基4 ml，制成細胞懸液。移至培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱孵育。每3天換液，培養6～8 d，待細胞融合貼滿瓶壁，封口后置37℃恒溫旋轉搖床210 r/min離心，除去懸浮細胞和貼壁不牢的細胞，6 h后取出，傳代培養。

1.2.2 星形膠質細胞的鑒定

采用GFAP多克隆抗體對純化后的星形膠質細胞進行免疫熒光染色(詳見1.4)。熒光顯微鏡高倍視野(200×)下隨機選取5個視野計數，GFAP陽性細胞數占總細胞數96%以上，符合實驗要求。

1.2.3 細胞分組及培養

將處于對數生長期的星形膠質細胞分為7組，分別加入0 μg/ml、0.001 μg/ml、0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml脂多糖培養6 h。將處于對數生長期的星形膠質細胞再次分為5組，加入0.1 μg/ml脂多糖培養0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。各組均設3個皿。

1.3 Western blotting

收集各組細胞提取蛋白。用預冷的PBS清洗細胞2遍，RIPA裂解液裂解30 min，細胞刮匙刮下細胞，4℃、14000 r/min離心15 min，收集上清液，加入蛋白上樣液30 μl(上清液的1/3)，煮沸3 min。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，-80℃冰箱保存待用。

提取的蛋白質行10%SDS-PAGE電泳，濃縮膠90 V，分離膠120 V；電轉至甲醇浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST(含10 mmol/L Tris-HCI、150 mmol/L NaCI、0.5%Tween 20，pH= 7.5)洗滌10 min，共3遍；加兔抗大鼠ski多克隆抗體(1∶100)、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶5000)，4℃冰箱過夜；TBST洗膜10 min，共3遍；加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室溫下2 h；TBST洗膜10 min，共3遍；滴加ECL發光液，GE凝膠成像系統測量各目的條帶灰度值，計算目的蛋白灰度值與內參β-actin蛋白灰度值之比。

1.4 免疫熒光染色

將原代細胞接種到蓋玻片上，貼壁后加0.1 μg/ml脂多糖0 d、2 d、4 d、6 d、8 d，PBS洗2遍，多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍，TritionX-100通透20 min，PBS洗2遍。滴加山羊封閉血清，37℃封閉30 min；吸凈封閉液，勿洗，加入小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶300)、兔抗大鼠ski多克隆抗體(1∶100)。玻片置于濕盒中，4℃冰箱過夜。PBS洗2遍，避光加山羊抗小鼠lgG(1∶300)、FITC標記山羊抗兔lgG(1∶300)，37℃溫箱避光孵育90 min。PBS洗2遍，避光下加DAPI，室溫孵育20 min；PBS洗2遍。甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

1.5 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行處理。每組數據來自3次獨立實驗，以(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 星形膠質細胞形態及純度鑒定

倒置顯微鏡下觀察，細胞傳代培養12 h后基本貼壁生長，可見細胞突起較多，且胞突之間有交叉連接，胞體呈星形(圖1)。活化的細胞形態發生明顯改變，如胞體肥大，胞突增粗、形狀不規則等。

免疫熒光化學染色后，熒光顯微鏡下可見細胞核呈圓形或橢圓形。GFAP陽性細胞(圖2)占總細胞數的百分比平均值96%(n=5)。

2.2 不同濃度脂多糖下ski蛋白表達

與0 μg/ml脂多糖組相比，不同濃度脂多糖均誘導星形膠質細胞表達ski蛋白，當濃度為0.1 μg/ml時，ski蛋白表達最高(P＜0.001)。見圖3。

2.3 脂多糖誘導星形膠質細胞ski蛋白表達的時相變化

0.1 μg/ml脂多糖誘導星形膠質細胞ski的表達具有時間依賴性，4 d時達到高峰(P＜0.001)，6 d時降低，但仍高于0 d組。見圖4。

圖1 星形膠質細胞形態(倒置顯微鏡,200×)

圖2 GFAP陽性細胞(免疫熒光染色,200×)

圖3 不同濃度脂多糖下星形膠質細胞ski蛋白表達

圖4 脂多糖誘導不同時間星形膠質細胞ski蛋白表達

2.4 ski在星形膠質細胞中的定位

0 d組ski蛋白呈低表達，主要表達于細胞核，胞質內表達較少。0.1 μg/ml脂多糖誘導2 d后，胞核內ski蛋白表達增高，胞質內ski蛋白增加不明顯；誘導4 d后，細胞突起明顯增粗，細胞形態由星形轉變為梭形甚至長桿狀，體積增大，且ski蛋白在胞核與胞質中表達均增加；誘導6 d后，ski蛋白在胞質與胞核中的表達又逐漸降低，且胞質降低更多。見圖5～圖9。

圖5 脂多糖誘導0 d時ski在星形膠質細胞中的表達(免疫熒光染色，400×)

圖6 脂多糖誘導2 d時ski在星形膠質細胞中的表達(免疫熒光染色，400×)

圖7 脂多糖誘導4 d時ski在星形膠質細胞中的表達(免疫熒光染色，400×)

圖8 脂多糖誘導6 d時ski在星形膠質細胞中的表達(免疫熒光染色，400×)

圖9 脂多糖誘導8 d時ski在星形膠質細胞中的表達(免疫熒光染色，400×)

3 討論

脊髓損傷可分為原發性和繼發性[11]。其中繼發性損傷是在原發性損傷基礎上，通過一系列病理生理反應，如炎癥、氧化應激、神經毒素釋放等，致使損傷區域發生自發性破壞性病變，進一步加重脊髓損傷程度，擴大損傷區域[12-13]。

炎癥反應是繼發性脊髓損傷的重要因素[14]，是星形膠質細胞反應性增生、膠質瘢痕形成、細胞壞死及失神經功能進行性發展的重要機制[15]。脂多糖作為Gram陰性菌細胞壁的主要組分，可觸發膠質細胞發生免疫反應，是公認的致炎劑[16-18]。脂多糖可以與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結合發揮其致炎作用，星形膠質細胞膜上存在TLR4[18]。本研究采用脂多糖誘導，體外模擬炎癥反應性星形膠質細胞。

本研究結果顯示，脂多糖誘導星形膠質細胞ski蛋白表達具有濃度依賴性，在0.001～0.1 μg/ml濃度下，ski蛋白表達濃度依賴性上升；更高濃度下，ski蛋白表達濃度依賴性下降。同時，脂多糖誘導ski蛋白表達具有時間依賴性：在0.1 μg/ml脂多糖誘導下，ski在4 d時達到峰值。

星形膠質細胞對脂多糖及脂多糖誘導的細胞因子免疫應答過程中，發生明顯活化，并通過炎癥放大和形成膠質瘢痕參與脊髓損傷及神經退行性變等過程[19-21]。研究顯示[9]，ski在成纖維細胞中可以通過降低炎癥細胞因子水平來發揮抗炎作用。另有研究顯示[22]，ski對轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路起負性調控作用；而TGF-β通路廣泛調節中樞神經系統炎癥反應、神經退行性變等病理生理過程[23]。

本研究顯示，在正常星形膠質細胞中，ski主要表達于細胞核，細胞質中表達較少；脂多糖誘導2 d時，ski蛋白表達上調，且胞質中也開始表達增多；在脂多糖誘導時間延長至6 d時，胞質中ski蛋白表達又逐漸降低。蛋白質的功能通常與其亞細胞定位相關，通過炎癥刺激前后ski蛋白亞定位的變化，我們推測，ski在炎癥反應性星形膠質細胞活化過程中起重要調控作用。

在星形膠質細胞炎癥反應過程中，ski蛋白表達上調，結合本課題組前期研究[24]，ski在脊髓損傷后的表達規律與GFAP表達規律高度一致，而GFAP作為星形膠質細胞特異性標志蛋白[25]，其表達程度可反映星形膠質細胞的活化程度[26]，提示ski參與星形膠質細胞的炎癥反應活化過程。

綜上所述，ski在炎癥反應性星形膠質細胞中表達上調，推測ski可作為炎性反應蛋白參與星形膠質細胞的炎癥反應過程。

深入研究ski在星形膠質細胞炎癥反應過程中的作用，將為治療神經炎癥尋找新的干預靶點。ski在星形膠質細胞炎癥反應過程過表達的相關機制仍需要進一步的研究。

[1]Bonnon C,Atanasoski S.c-Ski in health and disease[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):51-64.

[2]周開升,朱彥東,張海鴻,等.Ski在神經系統中的作用及機制

的研究進展[J].中國康復理論與實踐,2016,22(7):797-800. [3]Pekny M,Wilhelmsson U,Pekna M.The dual role of astrocyte

activation and reactive gliosis[J].Neurosci Lett,2014,565: 30-38.

[4]Donnelly DJ,Popovich PG.Inflammation and its role in neuroprotection,axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury[J].Exp Neurol,2008,209(2):378-388.

[5]Lukovic D,Stojkovic M,Moreno-Manzano V,et al.Concise review:reactive astrocytes and stem cells in spinal cord injury: good guys or bad guys?[J].Stem Cells,2015,33(4): 1036-1041.

[6]Fernandez AM,Fernandez S,Carrero P,et al.Calcineurin in reactive astrocytes plays a key role in the interplay between proinflammatory and anti-inflammatory signals[J].J Neurosci, 2007,27(33):8745-8756.

[7]de Rivero Vaccari JP,Lotocki G,Marcillo AE,et al.A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury[J].J Neurosci,2008,28(13):3404-3414.

[8]Zhu P,Li JX,Fujino M,et al.Development and treatments of inflammatory cells and cytokines in spinal cord ischemia-reperfusion injury[J].Mediators Inflamm,2013,2013:701970.

[9]Li P,Liu P,Xiong RP,et al.Ski,a modulator of wound healing and scar formation in the rat skin and rabbit ear[J].J Pathol, 2011,223(5):659-671.

[10]Catorce MN,Gevorkian G.LPS-induced murine neuroinflam

mation model:main features and suitability for pre-clinical assessment of nutraceuticals[J].Curr Neuropharmacol,2016,14 (2):155-164.

[11]Ahuja CS,Fehlings M.Concise review:bridging the gap:novel neuroregenerative and neuroprotective strategies in spinal cord injury[J].Stem Cells Transl Med,2016,5(7):914-924.

[12]Oyinbo CA.Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury:a nugget of this multiply cascade[J].Acta Neurobiol Exp(Wars),2011,71(2):281-299.

[13]Stenudd M,Sabelstr?m H,Frisén J.Role of endogenous neural stem cells in spinal cord injury and repair[J].JAMA Neurol,2015,72(2):235-237.

[14]Allison DJ,Ditor DS.Immune dysfunction and chronic inflammation following spinal cord injury[J].Spinal Cord,2015, 53(1):14-18.

[15]Leal-Filho MB.Spinal cord injury:from inflammation to glial scar[J].Surg Neurol Int,2011,2:112.

[16]Trinchieri G,Sher A.Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence[J].Nat Rev Immunol,2007,7(3): 179-190.

[17]Zhang X,Wang J,Qian W,et al.Dexmedetomidine inhibits tumor necrosis factor-alpha and interleukin 6 in lipopolysaccharide-stimulated astrocytes by suppression of c-Jun N-terminal kinases[J].Inflammation,2014,37(3):942-949.

[18]Heiman A,Pallottie A,Heary RF,et al.Toll-like receptors in central nervous system injury and disease:a focus on the spinal cord[J].Brain Behav Immun,2014,42:232-245.

[19]Dong Y,Benveniste EN.Immune function of astrocytes[J]. Glia,2001,36(2):180-190.

[20]Biesmans S,Acton PD,Cotto C,et al.Effect of stress and peripheral immune activation on astrocyte activation in transgenic bioluminescent Gfap-luc mice[J].Glia,2015,63(7): 1126-1137.

[21]Biesmans S,Meert TF,Bouwknecht JA,et al.Systemic immune activation leads to neuroinflammation and sickness behavior in mice[J].Mediators Inflamm,2013,2013:271359.

[22]Deheuninck J,Luo K.Ski and SnoN,potent negative regulators of TGF-beta signaling[J].Cell Res,2009,19(1):47-57.

[23]Boche D,Cunningham C,Docagne F,et al.TGFbeta1 regulates the inflammatory response during chronic neurodegeneration[J].Neurobiol Dis,2006,22(3):638-650.

[24]Zhou K,Nan W,Feng D,et al.Spatiotemporal expression of Ski after rat spinal cord injury[J].Neuroreport,2017,28(3): 149-157.

[25]Ikeshima-Kataoka H.Neuroimmunological implications of AQP4 in astrocytes[J].Int J Mol Sci,2016,17(8):E1306.

[26]Middeldorp J,Hol EM.GFAP in health and disease[J].Prog Neurobiol,2011,93(3):421-443.

Effect of Lipopolysaccharide on Ski Expression in Rats'Astrocytes

ZHAO Xin1,2,GUO Yong-qiang1,2,WANG Ming1,2,CHEN Tie-ge1,2,WU Ya-min3,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,the Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030,China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China;3.State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,the Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital, Third Military University,Chongqing 400042,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

Objective To explore how and where ski expresses under lipopolysaccharide(LPS)in rats'astrocytes.Methods Astrocytes were obtained from cerebral cortex of a newborn(within 3 days)Sprague-Dawley rat and cultured in vitro.Astrocytes were cultured with LPS in concentration of 0 μg/ml,0.001 μg/ml,0.01 μg/ml,0.1 μg/ml,1 μg/ml,10 μg/ml and 100 μg/ml for six hours;and cultured with LPS in concentration of 0.1 μg/ml for 0 day,2 days,4 days,6 days and 8 days.The level of ski was determined with Western blotting,and the location of ski was detected with indirect immunofluorescent staining.Results The expression of ski was induced by LPS,especially in the concentration of 0.1 μg/ml.The expression of ski induced with 0.1 μg/ml LPS peaked at 4 days of inducement and then decreased.Ski was mainly observed in nuclear in the normal astrocytes and the astrocytes induced with 0.1 μg/ml LPS for 6 days.However,it was observed in cytoplasm 2 and 4 days of inducement.Conclusion LPS could induce the expression of ski in rats'astrocytes,which may participate in inflammation.

ski;lipopolysaccharide;inflammation;astrocyte;rats

R364.5

A

1006-9771(2017)05-0514-06

2017-02-13

2017-03-13)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.005

[本文著錄格式]趙鑫，郭永強，王明，等.脂多糖對大鼠星形膠質細胞ski蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23 (5):514-519.

CITED AS:Zhao X,Guo YQ,Wang M,et al.Effect of lipopolysaccharide on ski expression in rats'astrocytes[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):514-519.

國家自然科學基金項目(No.30772299)。

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030；3.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所三室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042。作者簡介：趙鑫(1991-)，男，漢族，山東濰坊市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：張海鴻，主任醫師，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。