針康法對腦缺血大鼠神經功能和缺血半暗區皮層血管內皮生長因子受體表達的影響①

葉濤，唐 強，朱路文，陳慧杰，吳孝軍，李宏玉，田 源

針康法對腦缺血大鼠神經功能和缺血半暗區皮層血管內皮生長因子受體表達的影響①

葉濤1，唐 強2，朱路文2，陳慧杰2，吳孝軍1，李宏玉1，田 源1

目的觀察針康法對腦缺血大鼠神經功能和缺血半暗區皮層血管內皮生長因子受體Flt-1、Flk-1蛋白表達的影響。方法90只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分入假手術組、模型組、針刺組、康復組和針康組，每組再分為術后3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。模型組、針刺組、康復組和針康組用線栓法制備永久性局灶性腦缺血模型。假手術組和模型組不進行治療，針刺組采用頭穴叢刺針法治療，康復組給予跑臺訓練，針康組采用頭穴叢刺結合跑臺訓練治療。術后各時間點，采用改良神經損害嚴重程度評分(mNSS)進行評定，Western blotting法檢測缺血半暗區皮層Flt-1、Flk-1表達。結果與模型組比較，各治療組術后各時間點mNSS評分降低(P＜0.05)；術后7 d、14 d，與針刺組、康復組比較，針康組評分進一步降低(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組術后各時間點Flt-1、Flk-1蛋白表達升高(P＜0.05)；與針刺組、康復組比較，針康組Flt-1、Flk-1蛋白表達水平進一步升高(P＜0.05)。結論針康法治療可進一步改善腦缺血大鼠神經行為，可能與其持續促進缺血半暗區皮層Flt-1、Flk-1蛋白表達有關。

腦缺血；針康法；神經功能；血管內皮生長因子受體；Flt-1；Flk-1；大鼠

缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%，是由于栓塞、椎動脈和/或頸動脈閉塞或狹窄等因素造成腦部供血不足，引起腦組織缺血缺氧，導致局限性腦組織壞死的總稱，發病率、致殘率、致死率居高不下，并呈現年輕化趨勢[1]。針康法已經廣泛運用于腦卒中患者各類功能障礙的治療，臨床療效顯著，安全性和有效率得到大量臨床與基礎研究證實[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)是新生血管和側支循環形成所必須的調節系統，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1)表達的上調，可增強VEGF促血管新生、細胞分化與神經營養再生等效應[3-5]。本研究觀察針康法對腦缺血大鼠神經功能及缺血半暗區皮層Flt-1和Flk-1蛋白表達的影響，探討針康法神經保護作用的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，初始體質量(250±20)g，鼠齡10～12周，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，合格證書編號SYXK(黑) 2010007。飼養條件：溫度23～25℃，濕度55%～65%，12 h明暗交替。實驗前所有大鼠經適應性喂養1周及跑臺訓練3 d(15 m/min，30 min/d)，篩選可完成跑臺訓練方案的大鼠90只。實驗過程中大鼠的處置嚴格遵守動物倫理準則和指南的相關規定。

將90只大鼠編號，計算機生成含90個數的隨機數字表，任意選擇表中一個數為起始點對應大鼠編號1，從左至右，自上而下分別對應1～90號大鼠。用隨機數字除以5得余數確定每只大鼠的分組，余數0、1、2、3、4分別對應假手術組、模型組、針刺組、康復組及針康組，各組均有18只大鼠；同法將18只大鼠再分入3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。

造模失敗或死亡大鼠另選大鼠補充。

1.2 實驗試劑與儀器

Flt-1、Flk-1多克隆抗體：SANTA CRUZ公司。預染蛋白分子量標準：FERMENTAS公司。TEMED：AMRESCO公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。羊抗兔IgG-HRP：BEYOTIME公司。β-actin抗體：WANLEIBIO公司。

ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設備有限公司。Multiskan FC型酶標儀：THERMO公司。3K-18高速冷凍離心機：SIGMA公司。DYCZ-24DN型蛋白凝膠電泳儀、DYCZ-40D型轉印電泳儀、DYY-7C型電泳儀電源、WD-9405B型脫色搖床：北京六一儀器廠。BIS910凝膠成像分析系統：北京東勝創新生物科技有限公司。微量移液器：THERMO公司。

1.3 模型制備

參考Longa法[6]及前期實驗研究[7]制備永久性腦缺血大鼠模型。術前12 h禁食。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。頸部備皮，碘伏消毒后頸正中切口，暴露大鼠右側頸總、頸外及頸內動脈。結扎頸外、頸總動脈，用微動脈夾阻閉分叉處血流，在其下面3～5 mm處用2 ml注射器針頭斜刺一個“V”形小口；將頭端2 mm過蠟、長3 cm的魚線送入血管，備活結以固定線栓；松開動脈夾，將魚線送入頸內動脈，阻斷大腦中動脈血流。將活結扎死以固定線栓。消毒，逐層縫合。

假手術組大鼠不插入線栓，其余操作相同。

術后1 d，采用Longa 5級4分制標準[6]篩選模型，1～3分大鼠納入實驗。

1.4 方法

假手術組及模型組術后回籠飼養，不進行任何治療，只給予同等條件抓取。

針刺組于術后1 d，采用頭穴叢刺針法治療，每天1次。取百會穴及其左、右各旁開2 mm處，用直徑0.25 mm、長25 mm針灸針進行叢刺，快速捻轉1 min后留針2 h[7]。

康復組于術后1 d進行跑臺訓練，每次30 min，每天1次。坡度0°，速度：第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，第7天后15 m/min[7]。

針康組于術后1 d行針康法治療，每天1次。頭穴叢刺針留針期間進行跑臺訓練，頭穴叢刺方案與跑臺訓練方案同針刺組與康復組。

1.5 神經行為學評估

術后各時間點，大鼠干預結束后，采用改良神經損害嚴重程度評分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[8]評估大鼠神經功能恢復情況。見表1。

表1 mNSS評分標準

1.6 Western blotting

mNSS評分結束后，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，冰板上快速斷頭取腦，剝離大腦中動脈梗死周邊皮層缺血組織，液氮速凍5 min，-80℃冰箱保存備用。

取一定量標本，加入RIPA裂解液、PMSF制成蛋白勻漿，低溫孵育5 min，12000 r/min、4℃離心10 min，取上清液。BCA法測定上清液中蛋白質總濃度，上樣體積20 μl，含蛋白50 μg。10%SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉移到PVDF膜上(70 V,1.5 h)。TTBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，將膜放入Flt-1(1∶200)、Flk-1(1∶200)一抗中，4℃過夜。加入已羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)二抗，37℃孵育45 min，TBST洗膜，加入ECL發光孵育5 min，顯影，凝膠成像儀照相記錄，用Gel-Pro Analyzer 4.0對反應條帶進行定量分析，計算相對灰度。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0進行統計學處理，mNSS評分與Flt-1、Flk-1蛋白相對表達量均以(xˉ±s)表示，各時間點組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

各時間點，假手術組mNSS評分均為0；與假手術組比較，模型組評分升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復組、針康組評分均降低(P＜0.05)。術后7 d、14 d，與針刺組、康復組比較，針康組mNSS評分降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組各時間點mNSS評分比較

2.2 Flt-1

各時間點，假手術組Flt-1蛋白少量表達；模型組較假手術組Flt-1蛋白表達升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復組、針康組Flt-1蛋白表達升高(P＜0.05)；與針刺組、康復組比較，針康組Flt-1蛋白表達進一步升高(P＜0.05)。見表3、圖1。

表3 各組各時間點Flt-1蛋白表達

圖1 各組各時間點Flt-1蛋白表達

2.3 Flk-1

各時間點，假手術組Flk-1蛋白少量表達；模型組較假手術組Flk-1蛋白表達升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復組、針康組Flk-1蛋白表達升高(P＜0.05)；與針刺組、康復組比較，針康組Flk-1蛋白表達進一步升高(P＜0.05)。見表4、圖2。

表4 各組各時間點Flk-1蛋白表達

3 討論

針康法是基于腦卒中后各類功能障礙創立的針、康一體化治療體系，是中醫康復方法與現代康復技術有機融合，具有“針康同步、動態治療、整體康復”治療優勢[2]。前期我們借助現代實驗手段，在神經血管單元的框架內，從突觸重塑、神經血管再生、細胞凋亡及內源性神經干細胞等角度闡釋針康法干預效應的機理，取得一系列研究成果[2,9-16]，但針康法腦保護作用機制并不局限于此，仍有待進一步闡明。

mNSS從運動、感覺、平衡、反射缺損及異常活動四個方面評定神經功能。本研究顯示，針康法可加速神經功能的恢復，優于單一頭穴叢刺或康復治療，且遠期的神經功能預后更佳，充分體現兩者有機結合的優勢，與我們此前的研究一致。

圖2 各組各時間點Flk-1蛋白表達

血管發生是指從原有的血管上生出新的毛細血管，是缺血后腦組織再次獲得氧和營養的自然保護機制，可減輕缺血性腦損傷，促進神經功能恢復。VEGF作為機體內最重要的促血管生長因子，不僅可以促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性，誘導內皮細胞遷移和浸潤，促進新生血管和側支循環形成，還能直接作用于皮質、海馬和小腦等各部位神經細胞，發揮神經營養再生、神經保護和細胞分化等功能[3,5,17-18]。研究證實[5,19-22]，VEGF通過與其主要受體Flt-1和Flk-1結合而發揮生物學效應。腦缺血后，因低氧、缺血刺激，VEGF/VEGFR系統被激活，誘導大量新生血管形成，促進側支循環建立，使缺血腦組織得以重新灌注，改善組織缺氧與營養供應，從而減少神經元凋亡或死亡，降低腦損傷程度，促進神經功能的恢復。劉娟等[23]發現，補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血損傷的治療作用與增強VEGF及Flk-1表達有關。

前期我們已經證實，針康法可以促進缺血半暗區VEGF蛋白表達，促進腦缺血后微血管再生[13]。本研究顯示，腦缺血后，腦組織通過上調缺血半暗區Flt-1、Flk-1蛋白表達，參與調節VEGF介導的微血管重建、神經再生和神經元存活過程。雖然Flt-1、Flk-1蛋白表達在時間分布上高度一致，但Flk-1表達強度高于Flt-1，這可能與Flk-1是VEGF促內皮細胞有絲分化、血管新生等功能的主要調節者，而Flt-1側重于損傷區微循環重建，促進病理性血管發生與管腔成形

過程有關[3,24-25]。針刺、康復治療介入后，Flt-1、Flk-1表達明顯上調，促進、維持VEGF促血管新生、神經元存活和神經營養再生過程[13-14]；而針康法治療后，Flt-1、Flk-1蛋白表達水平始終高于單一針刺或康復治療，且14 d時仍有較高表達。

綜上所述，針康法治療可進一步改善腦缺血大鼠神經行為，可能與其持續促進缺血半暗區皮層Flt-1、Flk-1蛋白表達，正向調控VEGF促血管新生、神經元存活和神經營養再生過程，促進缺血區微血管重建，加快神經功能恢復有關。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Neurological Function and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptors,Flt-1 and Flk-1,after Focal Cerebral Ischemia in Rats

YE Tao1,TANG Qiang2,ZHU Lu-wen2,CHEN Hui-jie2,WU Xiao-jun1,LI Hong-yu1,TIAN Yuan1
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China;2.the Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

Objective To explore the effect of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of Flt-1 and Flk-1,members of vascular endothelial growth factor receptors,after permanent focal cerebral ischemia in rats.Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were divided into five groups,namely sham group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation group,and each group was further divided into 3-day,7-day and 14-day subgroups,equally.Their middle cerebral arteries were occluded except those of sham group.The sham and model groups accepted no treatment,while the acupuncture group accepted cluster needling of scalp acupuncture,the rehabilitation group accepted treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation group accepted both acupuncture and treadmill training.They were assessed with modified Neurologic Severity Score(mNSS)3,7 and 14 days after modeling,while the expression of Flt-1 and Flk-1 were determined with Western blotting.Results The mNSS score reduced in all the treatment groups(P＜0.05)compared with that of the model group at every time point,and was the least in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05)7 and 14 days after modeling among the treatment groups.Meanwhile,the expression of Flt-1 and Flk-1 protein increased in all the treatment groups(P＜0.05),and was the most in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05).Conclusion Acupuncture-rehabilitation therapy can promote the neurological function recovery in rat with permanent focal cerebral ischemia,which may be associated with the continuous inducement of Flt-1,Flk-1 protein expression in ischemic penumbra cortex.

cerebral ischemia;acupuncture-rehabilitation therapy;neurological function;vascular endothelial growth factor receptors; Flt-1;Flk-1;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)05-0520-05

2017-01-25

2017-02-21)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.006

1.國家自然科學基金項目(No.81273818;No.81473762)；2.黑龍江中醫藥大學領軍人才計劃項目(No.2012RCL02)。

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市150001。作者簡介：葉濤(1989-)，男，漢族，福建漳平市人，博士研究生，主要研究方向：腦卒中中醫康復基礎與臨床研究。通訊作者：唐強(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經系統疾病中醫康復基礎與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。[本文著錄格式]葉濤，唐強，朱路文，等.針康法對腦缺血大鼠神經功能和缺血半暗區皮層血管內皮生長因子受體表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(5):520-524.

CITED AS:Ye T,Tang Q,Zhu LW,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of vascular endothelial growth factor receptors,Flt-1 and Flk-1,after focal cerebral ischemia in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017, 23(5):520-524.