跑臺運動對腦外傷大鼠基質金屬蛋白酶-2表達的影響①

沈夏鋒，田 閃，吳 毅，朱玉連

跑臺運動對腦外傷大鼠基質金屬蛋白酶-2表達的影響①

沈夏鋒1，田 閃2，吳 毅2，朱玉連2

目的觀察跑臺訓練對腦外傷大鼠基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達的影響。方法55只成年Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=15)、對照組(n=20)和運動組(n=20)，后兩組復制中重度腦外傷模型，運動組進行電動跑臺訓練1周。術后6、12、18、24 d，采用足誤試驗評定運動協調功能；術后48 h，采用伊文思藍(EB)染色檢測大鼠血腦屏障通透性；術后7 d，Western blotting檢測MMP-2的表達。結果運動組在術后6 d評分明顯降低，但隨后增高，其中12 d、18 d及24 d評分比對照組高(F＞4.793, P＜0.05)；運動組EB滲出量顯著減少(t=-8.091,P＜0.001)；運動組MMP-2蛋白表達顯著下降(t=-13.12,P＜0.001)。結論大鼠腦外傷后早期進行跑臺訓練，可改善運動功能，可能與抑制MMP-2，從而減輕血腦屏障破壞有關。

腦外傷；跑臺訓練；血腦屏障；基質金屬蛋白酶；大鼠

腦外傷的病理生理過程包括原發性損傷和繼發性損傷[1]。原發性損傷直接由創傷引起，繼發性損傷持續時間較長，包括腦水腫、谷氨酸興奮性中毒、脂質過氧化、血腦屏障破壞、線粒體功能失調、炎癥、凋亡和細胞壞死等復雜的病理過程和級聯反應[2-4]。最近研究表明，血腦屏障的破壞貫穿于腦外傷原發性和繼發性損傷，在腦外傷病理生理中占據重要地位，是腦外傷治療的新方向[5-8]。

運動訓練是一組以身體鍛煉為主的治療方法，在國內外腦外傷后康復治療中應用廣泛，療效顯著。有研究表明，運動訓練可以減輕腦外傷大鼠的神經功能障礙，促進運動能力和學習記憶能力的恢復[9-12]。基于血腦屏障的完整性對腦外傷病理發展的重要意義，早期運動訓練對腦損傷后血腦屏障及相關的基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)的影響目前還缺乏相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年Sprague-Dawley大鼠55只，體質量250～270 g，由上海西普爾·必凱實驗動物有限公司提供，采用隨機數字表法分成假手術組15只、對照組20只和運動組20只。

1.2 造模方法

異氟醚吸入誘導麻醉，大鼠俯臥位固定于操作臺上，異氟醚全身麻醉。額頂部剃毛、消毒，沿中線矢狀線切開皮膚，暴露顱頂骨，用牙科電鉆沿中線右旁5 mm前囟部位做直徑5 mm骨窗，暴露完整硬腦膜。使用控制性皮質沖擊顱腦損傷儀器(PSI公司)，不銹鋼打擊頭對準骨窗，速度4 m/s、深度3.2 mm撞擊，造成運動組和對照組大鼠中重度腦外傷[8]。小心止血、縫合。大鼠出現部分反射活動消失、對側肢體功能障礙等表現，提示造模成功。

假手術組大鼠同法暴露硬腦膜，不進行撞擊，直接止血和縫合傷口。

1.3 干預方法

運動組從術后1 d起，每天在DSPT-202電動跑臺(立泰生物科技有限公司)上行運動干預，傾角0°，速度3 m/min，運動30 min，共1周。對照組和假手術組每天置于跑臺機上30 min，傾角0°，速度0。

1.4 觀察指標

1.4.1 足誤試驗

運動組和對照組各取12只大鼠，假手術組取7只大鼠，分別于術后6 d、12 d、18 d及24 d，參考Gerlinde介紹的操作步驟進行測評[12-13]。0分：左前爪完全踩空，未觸到橫檔即掉下，身體失去正常姿勢和平衡。1分：左前爪能放在橫檔上，但當該爪承重時滑下，同時大鼠掉落，影響正常行走。2分：左前爪能放在橫檔上，但當該爪承重時滑下，大鼠未掉落，也不影響行走，能維持平衡和正常步態。3分：左前爪能放在橫檔上，但在承重前大鼠迅速抬起該爪并移到另一個橫檔上。4分：大鼠想將前爪放到一個橫檔上，但因沒接觸到該橫檔而放在另一橫檔上。5分：大鼠將左前爪放在橫檔上，但由腕關節、肘關節或爪趾承重。6分：大鼠能將左前爪正中部位放在橫檔上。

1.4.2 血腦屏障完整性檢測

術后48 h，每組各取5只大鼠，經左股靜脈注入2%伊文思藍(Evans blue,EB)5 ml/kg。3 h后10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，左心室灌注生理鹽水300 ml，斷頭取腦，將損傷側腦組織浸泡在甲酰胺800 μl中，60℃避光48 h。離心取上清液，用酶標儀檢測(λ=632 nm)光密度值。每個樣本重復檢測3次。根據標準曲線計算大鼠腦組織中EB含量(μg/g)。

1.4.3 Western blotting

術后7 d，每組3只大鼠10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦，迅速于冰上分離大腦皮層，干冰速凍，-80℃冰箱保存。勻漿，冰上超聲裂解。4℃、14,000 g離心30 min，取上清。考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。配分離膠和積層膠，上樣量50 μg，60 V電泳至樣品進入分離膠中，100 V電泳至溴酚藍至凝膠末端；轉膜電壓100 V，時間90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉l h。加MMP-2抗體(1∶1500，ABCAM公司)，室溫振蕩1 h，4℃過夜。GAPDH(1∶1500，EPITOMICS公司)作為內參。加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4000，上海舒濟生物公司)，室溫振蕩l h。加熒光顯影劑，凝膠成像系統成像，Quantity One圖像分析系統(BIO-RAD公司)分析蛋白條帶光密度。將假手術組光密度設為1，計算運動組和對照組光密度與假手術組光密度的比值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。數據以(xˉ±s)表示，足誤試驗評分采用重復測量方差分析，血腦屏障和Western blotting數據采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 足誤試驗

假手術組足誤評分5.5分左右。對照組術后6 d評分明顯降低，以后無明顯增高的趨勢，基本穩定在4.2分左右。運動組術后6 d評分降低，12 d、18 d及24 d評分有所升高，且高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 運動組與對照組各時間點足誤試驗評分比較

2.2 血腦屏障完整性

假手術組基本未見藍染組織。對照組皮層和胼胝體明顯呈藍色，運動組皮層和胼胝體藍染組織減少。運動組EB滲出量(14.6±1.14)μg/g，顯著低于對照組(23.5±2.18)μg/g(t=-8.091,P＜0.001)。

2.3 Western blotting

對照組MMP-2蛋白相對表達量為(2.51±0.11)，顯著高于運動組(1.58±0.17)(t=-13.12,P＜0.001)。見圖1。

圖1 各組Western blotting結果

3 討論

血腦屏障主要由腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞終足、基底膜和周細胞構成。腦微血管內皮細胞依靠緊密連接構成一個連續密閉的屏障，不僅防止血液循環中的大分子物質進入腦實質，也承擔必要的物質交換，是維持神經系統內穩定的重要成分。血腦屏障受損可增加血源性中性粒細胞和白細胞在損傷血管內皮細胞處聚集和穿越至腦實質，加劇腦實質神經炎性反應，加重腦損傷[13]。

腦水腫是腦外傷急性期重要的病理過程，表現為腦組織含水量和腦體積增高。腦外傷引發腦水腫主要有兩種機制，即細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。MMPs是一組Zn2+依賴的可降解或修飾細胞外基質的蛋白酶，生理狀態下以酶原形式存在。細胞毒性水腫后細胞持續腫脹，引起細胞壞死，腦局部滲透狀態改變，激活MMPs；激活的MMPs可降解基底膜Ⅳ型膠原等成分，破壞血腦屏障完整性，從而引起毛細血管通透性增加，導致血漿成分和大分子物質外滲，形成血管源性腦水腫和出血轉化，進一步惡化腦水腫[14-16]。

許多腦外傷動物模型顯示，MMP-2和MMP-9在腦外傷后數小時至數天表達顯著增加[17-19]。臨床上中重度腦外傷患者血漿和腦脊液可檢測到MMP-2和MMP-9升高[20-21]。MMP-2和MMP-9的高表達與ICU住院時間延長和死亡率增高密切相關[22-23]。目前普遍認為，MMPs表達上調和活性增強是早期腦損傷的重要因素之一[24]。

本研究顯示，早期運動訓練能改善腦外傷大鼠運動協調功能，與以前的報道一致[9-12]。本研究也發現，腦外傷后大鼠血腦屏障破壞[25]，通透性增加；而運動訓練能減輕腦外傷后血腦屏障的破壞，一定程度上維持血腦屏障的完整性。這可能與抑制腦外傷后MMP-2蛋白表達增加有關。

由于神經炎癥和免疫與血腦屏障的密切聯系，在這些方面展開研究可能為進一步闡明腦外傷后康復的作用機制提供依據。

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Effect of Treadmill Exercise on Expression of Matrix Metalloproteinase-2 in Rats with Traumatic Brain Injury

SHEN Xia-feng1,TIAN Shan2,WU Yi2,ZHU Yu-lian2
1.Department of Rehabilitation Medicine,The First Rehabilitaion Hospital of Shanghai,Shanghai 200092,China; 2.Department of Rehabilitation,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

ZHU Yu-lian.E-mail:hsyykfkzyl@163.com

Objective To determine the effect of treadmill exercise on expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in rats following traumatic brain injury(TBI).Methods Fifty-five male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham(n=15),control(n= 20)and exercise(n=20)groups,the later two groups subjected to unilateral cortical contusion injury(CCI).All the rats were assessed with foot-fault test 6,12,18 and 24 days after CCI.Evans blue perfusion was used to evaluate the integrity of the blood-brain-barrier(BBB)48 hours after CCI.Protein expression of MMP-2 was determined with Western blotting one week after CCI.Results The score of foot-fault test improved more in the exercise group than in the control group 12,18 and 24 days after CCI(F＞4.793,P＜0.05).Evans blue extravasation was less in the exercise group than in the control group(t=-8.091,P＜0.001),as well as the expression of MMP-2(t=-13.12,P＜0.001). Conclusion Early treadmill exercise can improve the motor function in rats with TBI,which may associate with inhibition of MMP-2 expression to protect BBB integrity.

traumatic brain injury;treadmill exercise;blood-brain-barrier;matrix metalloproteinase;rats

R651.1

A

1006-9771(2017)05-0525-04

2017-03-08

2017-04-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.007

[本文著錄格式]沈夏鋒，田閃，吳毅，等.跑臺運動對腦外傷大鼠基質金屬蛋白酶-2表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2017,23(5):525-528.

CITED AS:Shen XF,Tian S,Wu Y,et al.Effect of treadmill exercise on expression of matrix metalloproteinase-2 in rats with traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):525-528.

楊浦區科學技術委員會、衛生和計劃生育委員會課題(No.YP15M13)。

1.上海市第一康復醫院康復科，上海市200092；2.復旦大學附屬華山醫院康復醫學科，上海市200040。作者簡介：沈夏鋒(1970-)，男，漢族，浙江蒼南縣人，副主任醫師，主要研究方向：神經康復。通訊作者：朱玉連。E-mail:hsyykfkzyl@163.com。