兩種不同慢傳輸便秘大鼠模型構建方法比較及對水通道蛋白的影響①

姬甜麗，錢海華

兩種不同慢傳輸便秘大鼠模型構建方法比較及對水通道蛋白的影響①

姬甜麗，錢海華

目的比較進食含復方地芬諾酯的飼料和用復方地芬諾酯混懸液灌胃復制大鼠慢傳輸便秘(STC)模型的差異。方法40只Sprague-Dawley大鼠隨機均分為灌胃對照(A)組、灌胃(B)組、飼喂對照(C)組、飼喂(D)組。B組采用復方地芬諾酯混懸液灌胃14 d，A組用等量生理鹽水灌胃，D組進食含有復方地芬諾酯的飼料120 d，C組進食普通飼料。造模成功后炭墨灌胃，觀察各組腸道炭墨推進率；免疫組織化學方法檢測水通道蛋白(AQP)3、AQP4蛋白含量。結果A、B組各有2只大鼠死亡。腸道炭墨推進率D組低于B組(P＜0.05)；AQP3、AQP4蛋白水平D組均高于B組(P＜0.05)。結論進食復方地芬諾酯飼料120 d較復方地芬諾酯灌胃14 d能夠更安全、穩定地復制STC模型。AQP可能參與STC的發生、發展。

慢傳輸便秘；模型；水通道蛋白；大鼠

在慢傳輸便秘(slow transit constipation,STC)模型復制中，復方地芬諾酯灌胃是一種常用方式，具有耗時短、定量較精確的優點。但注射器灌胃給藥，動物感染率較高，注射劑的制作對實驗室的要求也較高[1]；灌胃操作增加實驗人員被咬傷、撓傷的概率；同時操作不當極易導致動物誤吸窒息，從而增加動物的死亡率。長期進食含有復方地芬諾酯飼料的造模方式可明顯減少以上弊端。研究證明[2]，長期進食復方地芬諾酯可明顯降低結腸動力，減少腸道蠕動，減慢腸道傳輸速度，從而形成便秘，且未產生組織學損害，比較接近STC的結腸功能狀態。

自第一個水通道蛋白(aquaporin,AQP)于1988年被Agre等發現[3]，關于AQP與體液轉運之間關系的研究愈來愈多[4-8]。AQP在人體組織細胞中分布十分廣泛，是生物膜上的一種通道蛋白，通過調節生物膜的透水性，介導水的跨膜轉運。

STC是一種病因不明、病程冗長、病情頑固的疾病，是多種疾病[9-10](肛裂、痔瘡、直腸脫垂、睡眠障礙、焦慮抑郁、老年性癡呆等)的誘發因素，甚至可以誘發心腦血管疾病，直接威脅生命[11]。AQP與STC關系密切。AQP3與結腸水液代謝有密切聯系[8,12-13]，AQP4與便秘的關系不甚明確[14]。Ma等[15]和Wang等[16]剔除小鼠結腸AQP4基因，發現小鼠結腸對水吸收功能下降，大便中水分明顯增多，證明AQP4在結腸的表達與結腸水分吸收有關。也有文獻報道[17]，AQP4在STC患者結腸中表達很少，推測AQP4對水的重吸收未起到重要作用，對STC的發生、發展影響不大。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康普通級Sprague-Dawley大鼠40只，雌、雄各半，體質量(170±10)g。按完全隨機分組方法[18]，將大鼠分為灌胃對照組(A組)、灌胃模型組(B組)、飼喂對照組(C組)、飼喂模型組(D組)。雌、雄性大鼠分別編號1～20，從隨機數表按一定順序抄錄20個數字，分別除以4，余數1、2、3、0分別分入A、B、C、D組。如果組間大鼠數不等，則從鼠數多的組分入鼠數少的組：從隨機表任取一數字除以該組鼠數，余數對應的動物放入鼠數少的組，直至每組動物數相同。

實驗大鼠飼養于江蘇省中醫院實驗動物中心，每籠一只，室溫26℃，濕度45%～55%，人工光照，明暗各12 h，清潔安靜，通風良好。

1.2 實驗藥品、試劑與儀器

復方地芬諾酯片：常州康普藥業有限公司，批號1604009。電熱恒溫鼓風干燥機：上海博泰實驗設備有限公司。阿拉伯樹膠：廣州南方化玻公司分裝。活性炭：杭州木材總廠，參照文獻[19]配置墨汁。AQP3抗體(ab125219)、AQP4抗體(ab9512)：ABCAM公司。ElivsionTMSupper即用型免疫組化試劑盒(批號1511189921)、DAB顯色試劑盒(批號1508110031，20×)：福州邁新生物技術開發有限公司。BX41光學顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3 模型構建

各組處理方案見表1。

每5天稱量體質量。計數大鼠24 h大便，取各組大便各40粒，稱取濕重；放入電熱恒溫鼓風干燥機烘干，稱取干重，計算含水量。觀察造模前、造模后第1天、第7天大便計數及含水量。觀察大鼠一般情況。

造模成功標準：大便顆粒計數減少、大便體積減小，外觀干硬，質量較對照組小，含水量少于對照組。大鼠瘦小，毛發色澤度差。腸道炭墨推進程度較小，結腸留存大便數較多。

表1 各組大鼠處理方法

1.4 取材

便秘模型穩定后，停藥7 d。禁食24 h后，活性炭墨灌胃；30 min后予10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖腹部，計數大鼠結腸留存大便粒數。取出幽門至回盲部上端腸道(小腸)，測量總長度及被炭墨黑染長度，計算炭墨推進率。

取部分升結腸，浸泡于4%多聚甲醛。

1.5 免疫組化

升結腸切片、烤片，脫蠟至水。過氧化物酶消除，抗原修復，封閉。加AQP3、AQP4一抗孵育，清洗；加二抗，清洗；加三抗，清洗；DAB染色，清洗；蘇木素復染，清洗；脫水干燥，中性樹膠封片，拍照。每組取15張切片，用Image-pro Plus 6.0分析圖像平均光密度。

1.6 統計學分析

數據采用SPSS 19.0軟件處理。計量資料以(xˉ±s)表示，數據經正態檢驗符合正態性分布，多組均數間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 模型評定

A組、B組均有2只大鼠死亡，C組、D組無大鼠死亡。D組大鼠明顯瘦小，體質量小于C組，毛發暗黃，缺乏光澤；A組、B組間無明顯差異。模型大鼠大便較其對照組數量少、體積小，干硬，兩頭尖細，含水量明顯減少。停藥7 d后與停藥1 d相比，B組大便數有非常顯著性差異(P＜0.01)；D組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2、表3。

表2 造模前后各組24 h大便粒數比較

表3 造模前后各組大便含水量比較(g)

炭墨推進率A組高于B組(P＜0.05)，C組明顯高于D組(P＜0.01)，且D組低于B組(P＜0.05)。結腸留存大便粒數A組少于B組(P＜0.05)，C組明顯少于D組(P＜0.01)，且D組明顯多于B組(P＜0.01)。見表4。

表4 各組腸道炭墨推進率及存留大便粒數

2.2 免疫組化

各組均有AQP3陽性細胞，呈圓形、橢圓形褐色顆粒狀，A組、B組之間，C組、D組之間均有顯著性差異(P＜0.05)。B組、D組著色較深，分布以結腸黏膜頂部的絨毛上皮細胞為主，著色以細胞膜的頂部、基底及腔面為主，且頂部較基底、兩側膜表達多；杯狀細胞少見。D組多于B組(P＜0.05)。見表5、圖1。

AQP4在A組、C組表達較少，在B組、D組有一定表達，且以局灶表達為主。黏膜頂部高于底部，細胞基底面和腔面高于側壁，吸收細胞表達明顯而杯狀細胞無表達。D組多于B組(P＜0.05)。見表5、圖2。

表5 大鼠結腸AQP3、AQP4表達(平均光密度)

3 討論

臨床將便秘分為器質型便秘與功能型便秘，而功能型便秘又分為4類[21-22]：STC、排便障礙型便秘、混合型便秘、正常傳輸型便秘。其中STC臨床上尤為常見[23]，以結腸傳輸時間延長、進食后結腸高振幅推進性收縮活動減少為特點[24]，以大便干燥、排出困難、便次減少、便意缺乏為主要癥狀[25]。

復方地芬諾酯主要成分是鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品[26]。鹽酸地芬諾酯是一種阿片生物堿，為哌替啶的衍生物，能與胃腸道平滑肌上的阿片受體結合，提高張力，減緩胃腸道蠕動；同時可直接抑制腸黏膜感受器，阻斷局部黏膜蠕動反射，使腸內容物運輸減慢，從而增加腸液再吸收，具有較強的止瀉作用。硫酸阿托品是一種乙酰膽堿M受體阻斷劑，能抑制胃腸道平滑肌運動，且能降低地芬諾酯的依賴性。

大鼠自然進食含有復方地芬諾酯的飼料，此造模方式耗時長達120 d，但造模完成7 d后未因停止用藥而發生大便性狀改變，表明該造模方式更穩定。與灌胃14 d方式相比，不僅大鼠死亡率降低，且更加符合人類便秘形成的過程。本研究顯示，兩種造模方式均能復制符合STC臨床病理生理特點的大鼠模型，但進食復方地芬諾酯120 d復制的便秘模型更安全、穩定。

腸道水液代謝活躍。人體腸道每天轉運9～10 L液體中，約8 L通過小腸吸收，約1.5 L通過結腸吸收。結腸重吸收水分主要部位在近端結腸上皮細胞，故升結腸水液代謝與便秘關系更為密切。

腸道水液代謝紊亂是STC發病的重要機制，尤其與結腸水轉運異常相關。結腸上皮細胞排列緊密，細胞旁路水轉運受限，故跨細胞膜轉運成為結腸水分吸收的主要途徑。AQP是跨膜通道蛋白的重要成員。哺乳動物體內存在13種亞型，消化系統有9種亞型表達，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9在結腸均有表達[7,16,27-28]。

圖1 各組升結腸AQP3表達(免疫組織化學染色,40×)

圖2 各組升結腸AQP4表達(免疫組織化學染色,40×)

本研究顯示，AQP3、AQP4主要分布在近端結腸的吸收細胞而非杯狀細胞，這與結腸重吸收水的部位和細胞一致，推測表達于結腸的AQP3、AQP4是水液吸收的重要通道之一。兩種造模方式下，AQP3、AQP4表達有差異，進食復方地芬諾酯120 d后，AQP蛋白增多，水液吸收增多，結腸蠕動減緩，使便秘進一步發展。

多數通便藥通便作用與AQP關系密切，AQP可能是多數通便藥物的生物學基礎[13]。

給予大鼠MgSO4溶液，2 h時結腸內滲透壓達到峰值，但腹瀉不明顯；嚴重腹瀉發生在給藥后4～8 h；在給藥后2 h滲透壓最高時，AQP3表達較少，不能滿足水運輸需求，給藥后4～8 h滲透壓雖較2 h時下降，但此時AQP3水平處于峰值，大量水分從血管運輸至腸腔[29]。故容積性通便藥通便作用的關鍵環節不是升高滲透壓，而是調節AQP3的表達。

刺激性通便藥比沙可啶可直接刺激產生巨噬細胞，增加前列腺素E2的分泌，前列腺素E2作為旁分泌因子降低結腸黏膜上皮細胞AQP3表達，從而阻止水分從腸腔向血管轉移，起到通便作用。

本研究顯示，進食復方地芬諾酯120 d構建大鼠STC模型雖然耗時較長，飼料含藥量調整頻繁，但造模結果優于灌胃14 d造模，可以推廣于便秘的實驗研究。AQP3、AQP4在便秘結腸高表達，主要分布于上皮細胞，維持結腸的吸收功能。AQP在STC的形成、發展中發揮重要作用。針對AQP藥物靶向治療將成為治療便秘的一個新突破點，并已逐漸取得一定進展[30]。

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Comparison of Two Kinds of Rat Model for Slow Transit Constipation and Expression ofAquaporins in Them

JI Tian-li,QIAN Hai-hua
The First Clinical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China

QIAN Hai-hua.E-mail:haihuaqian@126.com

Objective To compare the rat model of slow transit constipation(STC)established with gavage or feeding compound diphenoxylate.Methods Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into gavage control group(A),gavage group(B),feeding control group(C)and feeding group(D)equally.Group B was given compound diphenoxylate suspension by gavage for 14 days while group A accepted isodose normal saline.Group D were given feed containing compound diphenoxylate for 120 days while group C accepted normal feed.Carbon ink was poured into stomachs to observe the propelling rate after modeling,and the content of aquaporin 3 and aquaporin 4 were detected with immunohistochemistry.Results There were two rats died in group A and group B,respectively.The carbon ink propelling rate was lower in group D than in group B(P＜0.05).Both aquaporin 3 and aquaporin 4 were more in group D than in group B(P＜0.05). Conclusion STC rat model can be established by eating diphenoxylate feed for 120 days,which is safer and more stable than that of gavage for 14 days.Aquaporins in colons may play a role in onset and development of STC.

slow transit constipation;model;aquaporin;rats

R574.62

A

1006-9771(2017)05-0529-05

2016-12-22

2017-02-13)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.008

[本文著錄格式]姬甜麗，錢海華.兩種不同慢傳輸便秘大鼠模型構建方法比較及對水通道蛋白的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(5):529-533.

CITED AS:Ji TL,Qian HH.Comparison of two kinds of rat model for slow transit constipation and expression of aquaporins in them[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):529-533.

國家自然科學基金項目(No.81573979)。

南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京市210029。作者簡介：姬甜麗(1990-)，女，漢族，山西高平市人，碩士研究生，主要研究方向：中醫藥治療肛腸疾病。通訊作者：錢海華，男，江蘇蘇州市人，博士，主任中醫師，主要研究方向：中醫藥治療肛腸疾病。E-mail: haihuaqian@126.com。