辛伐他汀對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株Shh相關(guān)蛋白的影響

費(fèi)洪新 張曉杰 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

·基礎(chǔ)研究·

辛伐他汀對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株Shh相關(guān)蛋白的影響

費(fèi)洪新 張曉杰 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討辛伐他汀對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株Shh相關(guān)蛋白的影響。方法 胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株隨機(jī)分成對(duì)照組，5-氟尿嘧啶(5-FU)組(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低劑量組(20，10，5 μmol/L)。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法和MTT法檢測(cè)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線和增殖抑制率；采用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力；采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR法檢測(cè)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞OD值、運(yùn)動(dòng)能力和Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 辛伐他汀通過(guò)抑制BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平在胰腺癌治療中發(fā)揮積極作用。

辛伐他汀；胰腺癌；BxPC-3細(xì)胞株

研究顯示，通過(guò)減弱腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的Hedgehog信號(hào)通路活化水平可以抑制胰腺癌(PC)細(xì)胞增殖〔1〕，Hedgehog信號(hào)通路還參與介導(dǎo)PC和胰腺組織纖維化〔2〕，調(diào)控PC干細(xì)胞的分化〔3〕；使用Hedgehog信號(hào)通路抑制劑SANT1可以下調(diào)Hedgehog信號(hào)通路活化〔4〕，在PC中Hedgehog信號(hào)通路Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá)上調(diào)，出現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路活化〔5〕，可見在PC中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)的Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá)失調(diào)。另外研究表明，辛伐他汀可以增加紫杉醇的抗腫瘤活性〔6〕，輔助橙皮苷治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔7〕，降低心肌梗死患者并發(fā)肺炎的發(fā)生率〔8〕，降低C-反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞介素-6水平而有利于慢性心力衰竭患者的康復(fù)〔9〕，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡〔10〕，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔11〕，減緩腎癌的細(xì)胞增殖〔12〕。雖然辛伐他汀的臨床應(yīng)用較為廣泛，但是中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)(CNKI)、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)等數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，辛伐他汀對(duì)PCBxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表達(dá)的研究尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討辛伐他汀對(duì)BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物和細(xì)胞株 辛伐他汀(宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批號(hào)0021509002)，5-氟尿嘧啶(FU)(Sigma公司)，人原位BxPC-3細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.2 試劑與儀器 兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Gli1多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗人Ptch1多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱(力康發(fā)展公司)，胎牛血清(HyClone公司)，HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶(HyClone公司)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國(guó)RT公司)，Trizol試劑盒、DEPC(上海生工生物工程)等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)〔13〕進(jìn)行人原位BxPC-3細(xì)胞株的培養(yǎng)，人原位BxPC-3細(xì)胞株在5%CO2、37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，BxPC-3細(xì)胞株恢復(fù)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后凍存，在液氮中保存人BxPC-3細(xì)胞株，開始預(yù)實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)開始復(fù)蘇人BxPC-3細(xì)胞株，用含10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，觀察人BxPC-3細(xì)胞株的基本狀態(tài)，人BxPC-3細(xì)胞株均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開始指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 細(xì)胞分組和用藥干預(yù) 生長(zhǎng)旺盛的人BxPC-3細(xì)胞株隨機(jī)分成對(duì)照組，5-FU組(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低劑量組(20，10，5 μmol/L)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)人BxPC-3細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線 利用臺(tái)盼藍(lán)可以穿透死亡或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并結(jié)合DNA的特點(diǎn)，從而鑒定出活細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人BxPC-3細(xì)胞株，胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，制備人BxPC-3細(xì)胞株的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/ml，選擇300 μl接種在24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d，使用辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)、5-FU(50 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)，模型組加上正常培養(yǎng)基，5%CO2、37℃的無(wú)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d。每日取單細(xì)胞懸液，按照單細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)的比例9∶1加入臺(tái)盼藍(lán)(4%)混合，3 min內(nèi)計(jì)數(shù)，收集數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，繪制各組人BxPC-3細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線。

1.4.2 噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)人BxPC-3細(xì)胞株的增殖抑制率 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人BxPC-3細(xì)胞株，胰酶消化，PBS洗滌3次，制備人BxPC-3細(xì)胞株的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞的濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/ml，人BxPC-3細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板；1 d后，辛伐他汀不同劑量進(jìn)行干預(yù)，5%CO2、37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，加入10 μl的MTT(5 mg/ml)及二甲基亞砜(DMSO)100 μl，搖床震蕩5 min，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度(OD)，按照公式計(jì)算人BxPC-3細(xì)胞株的增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4.3 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)人BxPC-3細(xì)胞株的運(yùn)動(dòng)能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人BxPC-3細(xì)胞株，胰酶消化，PBS洗滌3次，制備人BxPC-3細(xì)胞株的細(xì)胞懸液，濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/ml。黑色筆在6孔培養(yǎng)板的背后，每隔0.8 cm左右劃?rùn)M線，每孔至少穿過(guò)3條線。在每孔中加入人BxPC-3細(xì)胞株約5×105個(gè)細(xì)胞/ml，培養(yǎng)1 d后，垂直于背后，使用橫線畫劃痕。用PBS洗滌細(xì)胞3次/孔，去除劃下的人BxPC-3細(xì)胞。對(duì)照組加入正常完全培養(yǎng)基、5-FU組加入含有5-FU 50 μmol/L的完全培養(yǎng)基，辛伐他汀高、中、低劑量組分別加入含有辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。按0、24、48 h取細(xì)胞樣品，拍攝劃痕處，測(cè)量人BxPC-3細(xì)胞劃痕間的距離，使用人BxPC-3細(xì)胞的愈合百分比客觀評(píng)價(jià)人BxPC-3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。愈合百分比(%)=(1-48 h劃痕距離/0 h劃痕距離)×100%。

1.4.4 免疫組化(IHC)檢測(cè)人BxPC-3細(xì)胞Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表達(dá) 選擇人BxPC-3細(xì)胞株，胰酶消化，收集人BxPC-3細(xì)胞，離心后接種到載玻片中，待人BxPC-3細(xì)胞貼壁后，選擇各組載玻片。PBS沖洗人BxPC-3細(xì)胞3次，檸檬酸緩沖液中修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加一抗，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，滴加二抗，放入37℃電熱溫箱中30 min，PBS沖洗3次，0.05%DAB+0.03%H2O2顯色10 min，蘇木素5 min復(fù)染，PBS洗滌，鹽酸酒精(0.5%)分化數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明數(shù)秒，樹膠封片，鏡下觀察，計(jì)數(shù)人BxPC-3細(xì)胞的光密度值，并用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.5 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)人BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA的表達(dá) 按Trizol抽提試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA并計(jì)算濃度。設(shè)計(jì)引物Shh(上游5′-GCT CGG TGA AAG CAG AGA ACT-3′，下游5′-CCA GGA AAG TGA GGA AGT CG-3′)，Ptch1(上游 5′-CTC CTT TGC GGT GGA CAA-3′，下游5′-CCT CAG CCT TAT TCA GCA TTT C-3′),Smo(上游5′-CTG GTG TGG TTT GGT TTG TG-3′，下游 5′-CAG GTG GAA GTA GGA GGT CTT G-3′),Gli1(上游 5′-ATC CTT ACC TCC CAA CCT CTG T-3′，下游5′-CCA ACT TCT GGC TCT TCC TGT A-3′),GAPDH(上游 5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′，下游 5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′)由上海生工生物工程股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃、15 min，85℃、15 s。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，10 s；循環(huán)95℃、5 s，60℃、34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。收集熒光信號(hào)在60℃、34 s反應(yīng)階段中，使用iQTM5軟件分析PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的Ct值，計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct法)，結(jié)果越大則目的基因的表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線的影響 與對(duì)照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組第4、5、6、7天BxPC-3細(xì)胞株活細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組第4、5、6、7天BxPC-3細(xì)胞株活細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表1。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與5-FU組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株增殖抑制率的影響 與對(duì)照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組人BxPC-3細(xì)胞株OD值明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細(xì)胞株OD值明顯增加(P<0.05)。見表2。

2.3 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力的影響 與對(duì)照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組BxPC-3細(xì)胞株48 h劃痕距離明顯增加(P<0.05)，愈合百分比明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細(xì)胞株48 h劃痕距離明顯降低(P<0.05)，愈合百分比明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.4 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組人BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。見表4。

表2 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株增殖抑制率的影響

表3 辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力的影響

表4 辛伐他汀對(duì)BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白(OD值)及mRNA表達(dá)量(2-△△Ct)的影響

3 討 論

PC的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，PC與Raf〔13〕、Wnt、Hedgehog信號(hào)通路等密切相關(guān)，其中Hedgehog信號(hào)通路逐漸成為目前的研究熱點(diǎn)。在英文中Hedgehog是刺猬的含義，其相關(guān)的通路基因稱為刺猬基因。Hedgehog信號(hào)通路高度保守，參與機(jī)體組織器官的發(fā)育。在正常人群的成熟細(xì)胞中，Hedgehog信號(hào)通路表達(dá)水平較低，而在惡性腫瘤中如PC則會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)PC細(xì)胞增殖。

Hedgehog信號(hào)通路的基本構(gòu)成包括配體蛋白Hh蛋白、膜受體蛋白Ptch和Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Gli、Hh蛋白信號(hào)復(fù)合體(HSC)等。Hh蛋白主要分為Shh、Ihh、Dhh幾種類型，Shh蛋白是Hedgehog信號(hào)通路的研究熱點(diǎn)。Ptch蛋白主要分為Ptch1、Ptch2兩種類型，Ptch1可以與Hh蛋白結(jié)合而調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路的信息傳遞，Ptch1還可以調(diào)控下游的信號(hào)分子Smo的表達(dá)，倘若Ptch1表達(dá)上調(diào)，就會(huì)激活下游信號(hào)Smo蛋白，從而活化Hedgehog信號(hào)通路，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。核轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白主要分為Gli1、Gli2、Gli3幾種類型，其中Gli1蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，Gli1可以將Hedgehog信號(hào)通路中Shh、Ptch1、Smo的信號(hào)信息傳遞到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)靶基因(GAC CAC CCA)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如Gli可以作用于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病因子(Bcl)-2，促使腫瘤細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。經(jīng)過(guò)以上的分析，可見Hedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli1的表達(dá)與PC密切相關(guān)。

辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株的藥理作用存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，而辛伐他汀高、中劑量對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株生長(zhǎng)具有抑制作用，與5-FU 對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株的抑制作用等效，而辛伐他汀低劑量治療PC的效果較差。

辛伐他汀可以抑制人BxPC-3細(xì)胞株增殖，而低劑量對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株的抑制作用較差。預(yù)示隨著辛伐他汀劑量的增加，辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株增殖抑制能力逐漸增強(qiáng)，提示辛伐他汀抗PC存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

5-FU和辛伐他汀高、中劑量對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力具有很強(qiáng)的抑制作用，隨著劑量的增加，辛伐他汀對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力的影響就會(huì)更加明顯；而辛伐他汀低劑量對(duì)人BxPC-3細(xì)胞株的運(yùn)動(dòng)能力影響較差，以上顯示，開展辛伐他汀抗PC的研究需要選擇辛伐他汀高、中劑量(20、10 μmol/L)。

辛伐他汀不同劑量可以減弱Hedgehog信號(hào)通路活化水平，減少配體蛋白Shh的表達(dá)，降低膜受體蛋白Ptch1、Smo的表達(dá)，同時(shí)還降低核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的表達(dá)，進(jìn)而減少靶基因序列(GAC CAC CCA)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，減少下游相關(guān)的信號(hào)如Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制人BxPC-3細(xì)胞株增殖和生長(zhǎng)。而辛伐他汀低劑量對(duì)Hedgehog信號(hào)通路活化水平影響較差。本實(shí)驗(yàn)中人BxPC-3細(xì)胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表達(dá)下調(diào)的同時(shí)伴有人BxPC-3細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖水平和運(yùn)動(dòng)水平受到抑制，推測(cè)辛伐他汀抑制PC生長(zhǎng)增殖、運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)活性是通過(guò)抑制Hedgehog信號(hào)通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白和基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，辛伐他汀可以通過(guò)降低Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá)體現(xiàn)對(duì)BxPC-3的抑制作用，預(yù)示Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白或?qū)⑹侵委烶C的靶點(diǎn)蛋白。

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〔2016-09-16修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer

FEI Hong-Xin，ZHANG Xiao-Jie，ZHANG Ying-Bo.

Qiqihar Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

Objective To study the effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer.Methods BxPC-3 cell line of pancreatic cancer were randomly divided into control, 5-Fluorouracil(5-FU,50 μmol/L), simvastatin high-(20 μmol/L)，middle-(10μmol/L)， low-dose (5 μmol/L) groups. The trypan blue staining and MTT were used to determine growth curve of BxPC-3 cell line and OD values of pancreatic cancer. The cell scratch was used to determine the exercise capacity of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. Immunohistochemistry (IHC) and real-time PCR (RT-PCR) was applied for detecting Shh，Ptch1，Smo，Gli1 levels in BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.Results Compared with the control group, OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer, exercise capacity，Shh, Ptch1, Smo, Gli1 level were significantly decreased in 5-FU, simvastatin high-dose and middle-dose groups(allP<0.05).Conclusions Simvastatin plays a certain role in the treatment of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer by inhibiting Shh, Ptch1, Smo, Gli1.

Simvastatin；Pancreatic cancer；BxPC-3 cell line

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81173576，81373777，81173599)；黑龍江省自然科學(xué)基金(H201354)；黑龍江省教育廳資金(12521624，12531788，12531790)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院內(nèi)科研博士專項(xiàng)基金項(xiàng)目(QY2016B-21)

張英博(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤、肝纖維化、癡呆研究。

費(fèi)洪新(1978-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤、抑郁癥、癡呆、痛風(fēng)研究。

R285

A

1005-9202(2017)09-2081-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.001