幽門螺桿菌感染對十二指腸黏膜上皮細胞碳酸氫鹽轉運蛋白表達的影響

鄧時莉 金 海 文國容 庹必光

(遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563003)

幽門螺桿菌感染對十二指腸黏膜上皮細胞碳酸氫鹽轉運蛋白表達的影響

鄧時莉 金 海 文國容 庹必光

(遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563003)

目的 探究幽門螺桿菌(HP)感染對小鼠十二指腸上皮細胞碳酸氫鹽轉運蛋白表達的影響。方法 C57小鼠隨機分為四組，三組分別給予HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639感染，一組僅給予同等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃(對照組)，2 w后收集組織。體外培養十二指腸上皮細胞，與HP菌株共培養，其中對照組給予等量PBS干預，收集細胞。應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Western印跡檢測組織及細胞中碳酸氫鹽轉運蛋白表達的影響。結果 HP感染小鼠后，由吉姆薩染色鏡檢見，感染后可見大量紫藍色小體，呈逗點狀、短棒狀；細胞實驗：HP菌株NCTC11637與十二指腸上皮細胞共培養后應用RT-PCR擴增HP16srRNA，小鼠及細胞實驗均目的基因為單一擴增，擴增良好。小鼠及細胞實驗均3種HP菌種囊性纖維跨膜傳導調節因子(CFTR)、離子交換體(SLC)26A3及SLC26A6感染2 w后，碳酸氫鹽轉運蛋白mRNA及蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)。結論 從體內到體外，HP可通過調控碳酸氫鹽轉運蛋白含量來干預疾病的進展。

幽門螺桿菌；十二指腸潰瘍；碳酸氫鹽轉運蛋白；囊性纖維跨膜傳導調節因子(CFTR)；離子交換體(SLC)26A3；SLC26A6

十二指腸潰瘍主要的致病因素是幽門螺桿菌(HP)感染，其是通過細菌和宿主共同作用誘發疾病。HP侵襲腸黏膜上皮細胞，侵害黏膜自身防御和碳酸氫鹽修復平衡，從而誘發潰瘍疾病〔1〕。多種碳酸氫鹽轉運蛋白，如囊性纖維跨膜傳導調節因子(CFTR)、離子交換體(SLC)26A3、26A6可通過干預碳酸氫鹽分泌參與腸黏膜上皮細胞正常調控，從而減弱胃腸分泌物及蛋白酶對消化系統的損害〔2〕。HP提取物可抑制腸黏膜上皮細胞碳酸氫鹽分泌，提示HP可能參與碳酸氫鹽轉運蛋白合成過程〔3〕。本實驗通過體內和體外試驗闡明HP感染腸黏膜上皮細胞的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年6～11月遵義醫學院附屬醫院內鏡科檢查患者20例取正常十二指腸球部黏膜組織，男11例，女9例，年齡34～58歲。HP標準株SS1、NCTC11637、NCTC11639購于中國疾病預防控制中心。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus及Prime ScriptTMRT Reagent Kit試劑購于TaKaRa寶生物公司；iQTM SYBR Green Supermix購于Bio-Rad公司；吉姆薩(Giemsa)染液購于貴陽恒因公司；CFTR、SLC26A3、SLC26A6抗體購于CST公司，引物設計由寶生物公司完成。

1.3 HP感染小鼠模型 30只雄性C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華公司)，6～7周齡，18～20 g體重，隨機分為實驗組和對照組各15只。HP培養3 d后，滅菌后調整濃度為1×109CFU/ml，0.5 ml灌胃，對照組給予同等劑量磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃，2 d/次，共4次。分別予HP灌胃2 w時采集十二指腸近心端0.3 cm長腸段，-80℃保存后備用。同時取胃標本，進行感染程度鑒定。對照組給予同等劑量PBS灌胃。

1.4 吉姆薩染色 取模型十二指腸及胃標本的黏膜直接涂片，然后滴入吉姆薩染液，作用8 min，沖去多余浮色后，顯微鏡觀察并拍片。采用修訂好的悉尼標準進行十二指腸HP感染密度判定：無，標本未見HP；輕度，小于標本全長的1/3有少量HP浸潤；中度，標本全長的1/3～2/3有HP浸潤；重度，HP大量存在，浸潤達標本全長。

1.5 mRNA 表達檢測 引物序列見表1。所需器械均經高壓去RNA酶處理，并經0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實驗均在冰塊上操作，降低溫度對結果的影響。取保存的十二指腸段，加入1 ml TRIZOL，應用勻漿機裂解5 min；取培養好的腸上皮細胞，加入1 ml TRIZOL裂解5 min。然后依次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測定濃度及純度。應用逆轉錄試劑盒，嚴格按照說明書，將提取的RNA逆轉錄為cDNA，并嚴格按照擴增試劑反應要求，進行PCR體系的擴增及反應，并進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 用于擴增的各基因引物序列

1.6 蛋白印跡實驗 取培養后的腸黏膜細胞，加入含1%苯甲基磺酰氨(PMSF)的蛋白裂解液，12 000 r/min，4℃，離心30 min取上清，應用蛋白定量檢測蛋白濃度后，將各樣品濃度配齊，并加入上樣緩沖液煮沸變性。上樣跑膠，轉膜，封閉，加CFTR，SLC26A3，SLC26A6及內參β-actin一抗4℃過夜，第2天辣根過氧化物酶二抗常溫孵育2 h，在暗室內進行顯影定影，結果應用Image-plus軟件測量灰度值。

1.7 十二指腸上皮細胞原代培養 清洗十二指腸黏膜后，將組織剪碎放入0.5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的RPMI1640培養基(NRM)溶液中，充分搖勻。取組織碎片，加入含酶的NRM溶液，37℃水浴，終止消化后離心取細胞沉淀，應用含20 ng/ml的表皮生長因子及0.2 U/ml的胰島素的DMEM/F12培養基培養。選取HP菌株培養72 h收獲，刮取菌落，混于滅菌PBS混勻，加入十二指腸上皮細胞培養液中，按細菌細菌和細胞數量比為的比為100∶1培養，混合培養24 h后收集細胞備用。其中對照組予等量PBS溶液干預。

1.8 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 小鼠HP感染的鑒定 胃竇黏膜切片，由吉姆薩染色鏡檢見，HP感染后可見大量紫藍色小體，呈逗點狀、短棒狀，見圖1；取胃竇黏膜組織，應用RT-PCR擴增HP 16srRNA，可見，目的基因為單一擴增，擴增良好，退火溫度為60℃，其中擴增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖見圖2。

圖1 小鼠胃竇黏膜HP感染鑒定

2.2 HP感染對小鼠碳酸氫鹽轉運蛋白mRNA的影響 應用RT-PCR檢測HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表達變化。CFTR、SLC26A3及SLC26A6均為單一擴增，擴增良好，且與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表達顯著低于對照組(均P<0.05)，見表2，圖3。

2.3 HP感染對小鼠碳酸氫鹽轉運蛋白的影響 應用Western印跡檢測HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表達變化。與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)，見圖4。

圖2 小鼠16srRNA的擴增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖

2.4 HP感染小鼠模型定值密度 各型菌株感染小鼠模型，其定值密度無明顯差異(P>0.05)，見表3。因此隨機選取標準菌株NCTC11637進行后續細胞實驗。

2.5 原代培養的十二指腸上皮細胞培養 正常培養的十二指腸上皮細胞，以取出細胞開始培養為0 h，24～48 h細胞開始貼壁，7～8 d細胞開始增殖，10～14 d時細胞開始融合，見圖5。取十二指腸上皮細胞，應用RT-PCR擴增HP 16srRNA，可見，目的基因為單一擴增，擴增良好，退火溫度為60℃，其中擴增曲線，溶解曲線及溶解曲線峰圖見圖6。

2.6 HP感染對十二指腸上皮細胞碳酸氫鹽轉運蛋白mRNA的影響 應用RT-PCR檢測HP與十二指腸上皮細胞共培養24 h后CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表達變化。與對照組相比，NCTC11637菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

2.7 HP感染對十二指腸上皮細胞共培養24 h后碳酸氫鹽轉運蛋白的影響 與對照組相比，3種菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表達顯著低于對照組(均P<0.05)，見圖7。

表2 HP感染小鼠后2 w碳酸氫鹽轉運蛋白mRNA的表達水平

與對照組比較：1)P<0.05；表4同

表3 各菌株HP感染小鼠定值密度分析〔n(%),n=12〕

圖3 HP感染小鼠后2 w CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表達水平

圖4 HP感染小鼠后2 w碳酸氫鹽轉運蛋白的表達水平

圖5 原代培養正常十二指腸黏膜上皮細胞

圖6 原代培養的人16srRNA的擴增曲線、溶解曲線及溶解曲線峰圖

組別CFTRSLC26A3SLC26A6對照組339±011179±071169±019實驗組031±0011)059±0211)061±0101)

圖7 HP與十二指腸黏膜上皮細胞共培養24 h后碳酸氫鹽轉運蛋白的表達水平

3 討 論

1 高 文,胡伏蓮,成 虹，等.國產藥物組成的四聯療法對胃炎及十二指腸潰瘍患者幽門螺桿菌感染根除效果的前瞻性多中心隨機對照研究〔J〕.中華醫學雜志,2016；96(4):260-4.

2 Tarnawski AS，Ahluwalia A，Jones MK.Increased susceptibility of aging gastric mucosa to injury：the mechanisms and clinical implications〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(16)：4467-82.

3 Henriksn?s J，Phillipson M，Storm M，etal.Impaired mucus-bicarbonate barrier in Helicobacter pylori-infected mice〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006；291(3)：G396-403.

4 張江蘭，邢琛琨，任君旭，等.腸三葉因子與胃潰瘍關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(5)：1420-2.

5 王 慧，許惠玉，官 杰，等.真人養臟湯對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜sIgA、γδT細胞和超微結構的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(7)：1565-7.

6 方健松，馬媛萍，劉 暢，等.自噬介導腸黏膜屏障維持腸道穩態在炎癥性腸病中的作用〔J〕.實用醫學雜志，2016；32(8)：1367-9.

7 陳思羽，黃會云，陳 玉，等.腸屏障功能障礙及cingulin、claudin-2表達變化在潰瘍性結腸炎中的作用〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2016；25(1)：43-6.

8 沈 飛，冀子中，陳淑潔，等.鋁碳酸鎂對實驗性胃潰瘍的療效及其機制探討〔J〕.胃腸病學，2016；21(3)：151-5.

9 Megala J，Geetha A.Effect of pithecellobium dulce benth fruit extract on cysteamine induced duodenal ulcer in rats〔J〕.Indian J Exp Biol，2015；53(10)：657-64.

10 Gujral T, Kumar A, Priyamvada S,etal.Mechanisms of DRA recycling in intestinal epithelial cells: effect of enteropathogenic E. coli〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol, 2015；309(12):C835-46.

11 孔春雨.三聯療法治療老年幽門螺桿菌陽性消化性潰瘍患者的最佳時效〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(15)：4265-6.

12 劉建強，王 雯，王 蓉，等.四聯療法根除幽門螺桿菌對胃黏膜剝離術后潰瘍愈合的作用〔J〕.中華消化內鏡雜志，2015；32(11)：747-50.

13 程勝平，周世龍.復方嗜酸乳桿菌片聯合四聯療法治療幽門螺桿菌陽性潰瘍患者的療效與安全性〔J〕.中國藥師，2014；17(6)：993-5.

〔2015-07-19修回〕

(編輯 苑云杰)

The regulation of H.pylori infection on the expression of bicarbonate transporter proteins in duodenal mucosa epithelial cells

DENG Shi-Li, JIN Hai, WEN Guo-Rong,etal.

Department of Digestion, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou, China

Objective To investigate the influence of bicarbonate transporter proteins expression on duodenal mucosa epithelial cells of the H.pylori (HP) infected mice.Methods C57 mice were randomly divided into four groups. Three groups were given HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 to be infected, and the control group was given the same dose of PBS gavage. The organs were collected after 2 weeks. In vitro, duodenal epithelial cells were cultured and given HP strain to be infected, and the control group was given the same dose of PBS. Then, cells were collected. The expression of bicarbonate transporter proteins of organs and cells were detected by RT-PCR and Western blot.Results In animal experiment, after the infection, a large number of purple blue bodies were found, which were funny and short by Giemsa staining. After HP strain-NCTC11637 infection on duodenal epithelial cells, the amplification of HP 16srRNA was both simple and well by RT-PCR in mice and cells.After 2 weeks of HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 infection on mice, the mRNA and protein expressions of bicarbonate transporter proteins were significantly lower than those of control group in mice and cells.Conclusions In vivo and in vitro, HP can intervene disease progression by regulating the expression of bicarbonate transporter proteins.

H.pylori；Duodenal ulcer；Bicarbonate transporter proteins；Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)；Anion exchanger pendrin(SLC)26A3；SLC26A6

國家自然科學基金資助項目(No.81160054)

庹必光(1963-)，男，博士，碩士生導師，主任醫師，主要從事胃腸上皮細胞離子轉運研究。

鄧時莉(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事胃腸道離子通道的研究。

R656.6+2

A

1005-9202(2017)09-2086-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.003