膽管癌細胞中白細胞介素-6/Stat3通路對c-Met的調控作用

敬健雄 馮春紅 張春燕 夏先明 李 洪 代榮陽

(瀘州醫學院附屬醫院肝膽外科，四川 瀘州 646000)

膽管癌細胞中白細胞介素-6/Stat3通路對c-Met的調控作用

敬健雄 馮春紅 張春燕1夏先明 李 洪1代榮陽1

(瀘州醫學院附屬醫院肝膽外科，四川 瀘州 646000)

目的 探討膽管癌細胞中白細胞介素(IL)-6/Stat3和肝細胞生長因子(HGF)/c-Met通路的活化情況及其相互調控作用。方法 體外培養膽管癌細胞HCCC-9810，應用Western印跡檢測IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化及其相互調控，用ELISA試劑盒檢測HCCC-9810細胞IL-6和HGF的分泌，RT-PCR檢測IL-6/Stat3對c-Met轉錄的影響。結果 膽管癌細胞HCCC-9810中Stat3和c-Met均呈高度磷酸化，HCCC-9810細胞有較高水平IL-6分泌，無HGF分泌。IL-6/Stat3通路通過增強c-Met的穩定性維持膽管癌細胞c-Met的高表達，進而導致c-Met的異常活化。結論 膽管癌細胞中IL-6/Stat3信號通路對c-Met的異常活化起重要作用，IL-6/Stat3信號通路能通過c-Met信號通路發揮促膽管癌作用。

白細胞介素(IL)-6/Stat3信號通路；c-Met信號通路；膽管癌細胞

膽道慢性炎性損傷及其誘發的膽管上皮細胞炎性增殖是膽管癌(CCA)發生的重要基礎〔1～4〕。CCA惡性程度高、預后差，雖然手術切除是目前CCA治療的有效手段，但絕大多數患者在確診時已經錯失手術時機，而根治性手術切除后患者的5年生存率也僅為20%～40%〔1～4〕。CCA細胞的高增殖能力是促成其高度惡性的兩大危險因素，然而目前對其增殖的分子機制還知之甚少，因而研究調控CCA細胞增殖的信號分子和通路有望為CCA的治療提供新的分子靶點和臨床策略。白細胞介素(IL)-6參與多種生物學功能調控，主要包括炎癥反應、細胞增殖調控和細胞分化調控〔5～7〕。已有較多研究表明IL-6信號的異常與多種腫瘤的發生和進展關系密切〔8～10〕。在CCA中已經發現了IL-6信號通路的異常活化，且IL-6對維持CCA細胞的惡性表型起重要作用〔11～13〕。然而，IL-6如何參與調控CCA過程的機制還很不清楚。已經明確肝細胞生長因子(HGF)的受體c-Met屬于促癌基因，c-Met的異常活化和CCA的惡性增殖密切相關〔14,15〕，但是c-Met在CCA中異常活化的機制尚不明確。IL-6與c-Met在CCA中的調控關系尚未見報道，本實驗研究CCA細胞中IL-6與c-Met信號通路的活化狀態及其相互調控。

1 材料與方法

1.1 材料 Stat3抑制劑(Stattic)，蛋白質合成抑制劑Cycloheximide(CHX)和細胞因子IL-6購自Sigma公司；c-Met抑制劑PF-2341066(PF)購自Selleck Chemicals公司；IL-6和HGF ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司；抗β-actin一抗購自Santa Cruz公司；抗phospho-Met(Tyr1234/1235)、c-Met、phospho-Stat3(Tyr705)、Stat3和gp130一抗購自Cell Signaling公司；二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 將人CCA細胞系HCCC-9810以含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，置于CO2培養箱中(5%CO2、95%空氣、37℃)，視情況換液。培養細胞分別用Stattic(10 μmol/L)、IL-6(50 ng/ml)及PF(100 nm/L)處理，并按對應時間點收集細胞。

1.2.2 RT-PCR 6孔板細胞加1 ml TRIzol并置于DEPC水處理過的1.5 ml EP管中室溫5 min。加氯仿1/5體積(0.2 ml)，輕柔充分混勻，室溫靜置3～5 min。4℃，12 000 r/min離心，15 min。轉移上層水相(約400 μl)于另一DEPC水處理過的1.5 ml EP管中，加異丙醇500 μl，混勻后室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心，10 min。棄上清，加75%乙醇1 ml洗沉淀。4℃，7 500 r/min離心，5 min，棄上清，空氣干燥沉淀5～10 min。沉淀溶于10～20 μl DEPC水中，電泳觀察，測濃度。1 μl隨機引物+2 μg RNA+DEPC水(總體積為15 μl)，70℃，5 min。加入1 μl dNTP，5 μl緩沖液,1.25 μl RNasin,1 μl M-MLV,1.75 μl DEPC水(總體積為25 μl)，37℃，60 min。產物用于PCR檢測。

1.2.3 Western印跡分析 提取細胞蛋白質，SDS-PAGE電泳分離。利用半干式電轉移儀將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，120 min。轉膜結束后將PVDF膜加入5%牛血清白蛋白進行封閉，室溫1 h。封閉結束后，將印跡有目的蛋白的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜與其抗體稀釋液置于4℃孵育過夜。用1×TBST洗膜3次(5 min/次)，印跡有目的蛋白的PVDF膜與二抗稀釋液室溫振搖孵育1 h。用1×TBST洗膜3次(5 min/次)。最后將化學發光劑浸透PVDF膜，并置于凝膠成像系統，放射自顯影5 min，即得到目的蛋白的免疫印跡圖譜。

1.2.4 ELISA分析 依據說明書提供的方法，檢測細胞培養液中IL-6和HGF的水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行方差分析。

2 結 果

圖1 CCA細胞中IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化

2.1 CCA細胞IL-6/Stat3和HGF/c-Met通路的活化 如圖1A所示，在無IL-6刺激(對照組)時CCA細胞HCCC-9810已經有較高水平的Stat3磷酸化，而IL-6刺激能夠進一步增強Stat3的磷酸化。此外，在無HGF刺激(對照組)的CCA細胞HCCC-9810中也檢測到了較高水平的c-Met磷酸化，而HGF刺激也明顯增強了c-Met的磷酸化(圖1B)。CCA細胞HCCC-9810的培養液中可以檢測到IL-6，其值為150±12.5。實驗未檢測到CCA細胞HCCC-9810有HGF分泌，表明CCA細胞HCCC-9810有IL-6/Stat3和HGF/c-Met信號通路的高水平活化。

2.2 CCA細胞中IL-6/Stat3通路對c-Met活化的影響 在Stat3抑制劑Stattic的作用下，CCA細胞HCCC-9810中c-Met的磷酸化水平明顯下調，在作用3 h以后Stattic對c-Met磷酸化的抑制效果類似于c-Met抑制劑PF。值得注意的是，在Stat3抑制劑Stattic的作用下，CCA細胞HCCC-9810中c-Met的蛋白水平也出現了顯著下調，而c-Met抑制劑PF對c-Met的蛋白水平則無影響(圖2A)。在給予IL-6刺激時，我們發現在膽管癌細胞HCCC-9810中c-Met蛋白水平有明顯上調(圖2B)，表明CCA細胞HCCC-9810中c-Met的異常高表達與活化與IL-6/Stat3通路密切相關。

2.3 IL-6/Stat3通路對CCA細胞c-Met穩定性的影響 如圖3所示，CCA細胞HCCC-9810中c-Met的轉錄水平不受IL-6刺激和Stat3抑制劑Stattic作用的影響，對照組為1.0±0.25，Stattic組為1.16±0.06，IL-6組為1.23±0.07，提示CCA細胞HCCC-9810中IL-6/Stat3信號通路對c-Met表達的影響不在轉錄水平，Stat3抑制劑Stattic促進了c-Met蛋白的降解，表明CCA細胞HCCC-9810中IL-6/Stat3信號通路的異常活化導致了c-Met的異常高表達，進而導致了c-Met的異常活化。

圖2 CCA細胞中IL-6/Stat3信號通路對c-Met信號的調控

圖3 IL-6/Stat3對CCA細胞c-Met蛋白水平的影響

3 討 論

已經有較多報道指出c-Met參與了結腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和CCA的過程〔14～17〕。前期結果發現阻斷c-Met明顯抑制了CCA細胞的增殖，我們推測c-Met能夠通過促增殖作用在CCA中發揮促癌效應〔14〕。研究明確提出HGF過度表達和分泌及c-Met的過表達在c-Met的異常活化中起重要作用〔16〕，提示CCA細胞HCCC-9810中c-Met的異常活化與HGF的分泌無關，CCA中c-Met的異常活化與其過表達有關。

近年來對炎癥反應與腫瘤關系的研究十分活躍。IL-6/Stat3信號通路不僅是調控炎癥反應的關鍵通路之一，也在腫瘤過程中扮演了重要角色〔8～10〕。Stat3是IL-6的核心效應分子，此外，IL-6也通過MEK/ERK和PI3K/AKT等信號途徑發揮其生物學功能〔5～10〕。本文結果表明CCA細胞中Stat3和c-Met的異常活化機制不一致，Stat3的異常活化與IL-6表達分泌有關，而c-Met的異常活化則不依賴于HGF。阻斷Stat3抑制了CCA細胞中c-Met的磷酸化水平，而阻斷c-Met則對Stat3的磷酸化無明顯影響。由此可以推測，在CCA細胞HCCC-9810中c-Met的活化受到了IL-6/Stat3信號通路的調控。Stat3的阻斷不僅抑制了c-Met的磷酸化，也下調了c-Met的蛋白水平，這提示IL-6/Stat3是通過調控c-Met的表達水平達到對c-Met磷酸化的調控。IL-6刺激可以上調c-Met的蛋白水平的實驗結果進一步證實了IL-6/Stat3是通過調控c-Met的表達水平達到對c-Met磷酸化的調控。

由于基因表達調控受控于轉錄和蛋白兩個水平，實驗分析了膽管癌細胞中IL-6/Stat3對c-Met的表達調控機制。本文結果說明CCA細胞中IL-6/Stat3信號通路對c-Met的表達調控發生在蛋白水平。本文結果表明IL-6/Stat3信號通路對CCA細胞HCCC-9810中c-Met蛋白的穩定性有促進作用。上述結果均表明IL-6/Stat3信號通路通過促進c-Met蛋白的穩定性達到對c-Met信號的調控，進而促進了CCA細胞HCCC-9810中c-Met的異常活化，至于IL-6/Stat3是通過何種機制調控c-Met蛋白的穩定性需要進一步的實驗探究。

綜上所述，本實驗發現IL-6/Stat3信號通路的活化導致了CCA細胞中c-Met蛋白穩定性增強進而導致c-Met異常高表達。由于CCA細胞中未檢測到HGF分泌，因而CCA細胞中c-Met的異常活化不依賴于HGF，而是依賴于c-Met的異常高表達。鑒于c-Met信號通路在CCA中的促癌作用，可以推測IL-6/Stat3信號途徑能夠通過促進c-Met信號的活化而發揮促CCA作用。對IL-6/Stat3和c-Met信號通路的異常及其調控機制在CCA細胞中的促癌作用及其分子機制開展進一步實驗研究有望為CCA的分子靶向治療提供新的策略。

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〔2016-02-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Role of IL-6/Stat3 pathway in the regulation of c-Met in cholangiocarcinoma cells

JING Jian-Xiong,FENG Chun-Hong,ZHANG Chun-Yan,etal.

Department of Hepatobiliary Surgery, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China

Objective To investigate the activation of the interleukin (IL)-6/signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) and hepatocyte growth factor/c-Mer (HGF/c-Met) pathways in human cholangiocarcinoma cells and assess the cross-talk between the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in human cholangiocarcinoma cells.Methods Cholangiocarcinoma cells HCCC-9810 were cultured in vitro.The activation of the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in cholangiocarcinoma cells was measured by Western blot.The cross-talk between the IL-6/Stat3 and HGF/c-Met pathways in cholangiocarcinoma cells was measured by Western blot.The secretion in IL-6 and HGF in cholangiocarcinoma cells was measured by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The effect of the IL-6/Stat3 pathway on c-Met mRNA levels was assessed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Results HCCC-9810 cells showed strong expression of phosphated Stat3 and phosphated c-Met.The secretion in of IL-6, but not HGF, was detected in HCCC-9810 cells.The IL-6/Stat3 pathway resulted in the abnormal activation of c-Met through enhancing the stability of c-Met.Conclusions In cholangiocarcinoma cells, the IL-6/Stat3 pathway plays an important role in sustaining the abnormal activation of c-Met.Thus, c-Met is involved in the effect of IL-6/Stat3 on cholangiocarcinoma promotion.

IL-6/Stat3 pathway;c-Met pathway;Cholangiocarcinoma cells

國家自然科學基金(No.81472312)；教育部新世紀優秀人才支持計劃(No.NCET-11-1058);四川省優秀青年基金培育項目(No.2013JQ0045);瀘州市-瀘州醫學院聯合項目(No.2013LZLY-J06);四川省-瀘州市-瀘州醫學院聯合項目(No.14JC0082;No.14ZC0070)

代榮陽(1975-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事肝膽腫瘤研究。

敬健雄(1989-)，男，碩士，主要從事肝膽腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2095-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.006

1 瀘州醫學院生物化學教研室