Mac-1基因缺失抑制小鼠黑色素瘤肺轉移的機制

段有發 陳 堅 葉志金 王麗京 章倩倩

(廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

Mac-1基因缺失抑制小鼠黑色素瘤肺轉移的機制

段有發 陳 堅 葉志金 王麗京 章倩倩

(廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

目的 探討Mac-1基因缺失對黑色素瘤肺轉移的抑制作用。方法 Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠配種擴群以獲得實驗需要的數量，取指數生長期B16細胞，分別尾靜脈注射到對照組C57BL/6J小鼠和實驗組Mac-1-/-小鼠體內，統計小鼠生存率及腫瘤肺轉移結節數，并通過H&E觀察肺組織中微轉移灶。結果 通過配種擴群獲得了大量實驗用純合子Mac-1基因敲除小鼠(Mac-1-/-)。與對照組相比，Mac-1缺失后尾靜脈注射B16細胞的小鼠存活率顯著提高(P<0.001)；并且大體觀察Mac-1缺失后小鼠腫瘤轉移肺結節數目顯著減少(P<0.001)，抑制率達到75%；進一步通過對肺組織包埋、切片和H&E觀察發現，Mac-1缺失后小鼠肺組織中腫瘤微轉移灶顯著減少(P<0.001)。結論 Mac-1基因缺失能顯著抑制小鼠黑色素瘤的肺轉移。

Mac-1缺失；黑色素瘤；肺轉移

Mac-1是整合素β2亞族的一個重要成員，是由α(CD11b)和β(CD18)兩個亞基以非共價鍵的方式締合而成的異二聚體。Mac-1主要表達于白細胞膜，在粒細胞和單核巨噬細胞表面廣泛表達，部分淋巴細胞也有少量表達，是參與機體防御作用和免疫反應的重要的白細胞黏附分子，主要影響白細胞的遷移和組織浸潤〔1,2〕。腫瘤生長微環境中有大量白細胞，越來越多的研究表明，腫瘤微環境中的白細胞能夠促進腫瘤的生長和轉移〔3～9〕。因此，Mac-1的缺失可能對腫瘤的生長和轉移具有重要影響。目前，Mac-1缺失對黑色素瘤轉移的影響尚不清楚。黑色素瘤是由異常黑色素細胞過度增生引發的惡性腫瘤，是皮膚腫瘤死亡病例中的主要類型〔10～16〕。黑色素瘤惡性程度高，易轉移，侵襲性強，預后極差，容易通過血液發生肺轉移〔17〕。本研究利用Mac-1基因敲除小鼠與其背景鼠C57BL/6J建立實驗性黑色素瘤肺轉移模型，研究Mac-1基因缺失對黑色素瘤肺轉移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株、實驗動物、主要試劑和儀器 B16小鼠黑色素瘤細胞株購于中國科學院細胞庫，培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基中，37℃貼壁培養在5% CO2培養箱中，待細胞處于指數生長期時進行實驗。Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠12只(雌性和雄性各6只)，7周齡，購于美國Jackson實驗室；C57BL/6J小鼠20只，雌性和雄性隨機，6～8周齡，SPF級，購于廣東省醫學實驗動物中心。DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)。獨立送回風凈化籠具(蘇杭實驗動物設備廠)；離心機(Thermo，美國)；CO2培養箱(Thermo，美國)；正置顯微鏡、體視顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 Mac-1基因敲除小鼠的配種擴群 Mac-1-/-小鼠飼養于SPF級環境中，飼養室內的溫度維持在(25±3)℃，相對濕度40%～60%，噪音低于60 dB，氨濃度不超過20 ppm，換氣次數為10～20次/h，自動光控時間為12 h明/12 h暗，飼養室內定期用消毒水進行清潔消毒。8～12周齡Mac-1-/-小鼠以雄∶雌=1∶3的最佳比例配種，共配兩籠，及時記錄產仔日期和產仔數，3周齡時將仔鼠雌雄分籠飼養，對小鼠進行剪趾編號。

1.3 小鼠實驗性黑色素瘤肺轉移模型的建立 分別取C57BL/6J小鼠21只和Mac-1-/-小鼠22只，周齡相同，雌性和雄性隨機。取對數生長期B16細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用生理鹽水配制成5×108/L的細胞混懸液。用臺盼藍染色確定活細胞數在95%以上，通過尾靜脈注射B16細胞混懸液0.2 ml/只。

1.4 腫瘤肺轉移結節的測定 給小鼠尾靜脈注射B16細胞后，每組取8只小鼠，在第18天時將小鼠脫頸椎處死，取肺組織，觀察大體形態并拍照，體視顯微鏡下計數腫瘤肺轉移結節數。

1.5 小鼠生存率統計 每天觀察統計腫瘤肺轉移實驗后剩余小鼠的生長生活情況，記錄每只小鼠的自然死亡時間，并統計小鼠生存率。

1.6 H&E染色 取注射B16細胞后18 d處死的小鼠肺組織，固定、脫水后石蠟包埋，切片(3 μm)，脫蠟后蘇木精伊紅染色，鏡下觀察組織形態。

1.7 統計學分析 采用SigmaPlot統計軟件繪制統計圖及進行t檢驗。

2 結 果

2.1 Mac-1-/-小鼠繁育結果 Mac-1-/-小鼠按照雄∶雌=1∶3的最佳比例配種，配種兩籠，擴大種群，平均每只母鼠的窩產仔數為7.5只，共產仔45只。

2.2 Mac-1缺失對B16肺轉移小鼠生存率的影響 注射B16細胞后C57BL/6J小鼠與Mac-1-/-小鼠在23 w開始出現死亡。C57BL/6J小鼠在32 w時死亡率達到80%左右，在第40周時死亡率達100%；而Mac-1-/-小鼠則在45 w時死亡率才達到80%，50 w時死亡率達100%(見圖1)。與對照組C57BL/6J小鼠相比，實驗組Mac-1-/-基因敲除小鼠生存時間顯著延長，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.3 Mac-1缺失對黑色素瘤肺轉移的影響 在注射B16細胞后第18天處死實驗組Mac-1-/-小鼠和對照組C57BL/6J小鼠，解剖后取肺組織，大體觀察發現Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺轉移結節顯著少于對照組C57BL/6J小鼠(圖2)；計數后發現Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺轉移結節(11.43±2.24)顯著少于對照組C57BL/6J小鼠(54.86±13.50)(P<0.001)。

H&E染色，鏡下可清楚觀察到肺組織有癌細胞浸潤，并且Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺組織中微轉移灶顯著小于對照組，并且數目顯著減少。見圖3。

圖1 注射B16細胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠生存率觀察

圖2 注射B16細胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠轉移肺結節觀察

圖3 注射B16細胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠肺組織H&E染色

3 討 論

Mac-1主要在粒細胞和單核巨噬細胞的細胞膜上表達，少量表達于部分淋巴細胞〔1〕。Mac-1屬于白細胞表面的重要黏附分子，可與活化的血管內皮細胞表面上的ICAM-1、ICAM-2等配體高親和力結合，促使白細胞與血管內皮細胞牢固黏附，從而介導白細胞的游走和滲出〔18,19〕。

腫瘤組織中存在大量白細胞，在腫瘤細胞的生長和轉移中發揮著重要作用〔9〕。巨噬細胞能夠分泌血管內皮生長因子，促進腫瘤血管的生成，從而促進腫瘤的生長〔3〕。Wang等〔4〕研究發現，巨噬細胞能夠分泌MMP7，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。有臨床研究表明，在腫瘤組織中，浸潤性巨噬細胞的數量越多，則腫瘤血管微密度(MVD)和增殖指數(PI)越高，腫瘤細胞的生長越旺盛，腫瘤的預后越差〔5,20〕。在腫瘤微環境中，腫瘤相關巨噬細胞能夠分泌血管生成因子，從而促進腫瘤血管的生成，進而為腫瘤的生長和轉移提供了營養和通道。另外，腫瘤相關巨噬細胞可以通過抑制機體內抗腫瘤免疫應答來促使腫瘤細胞逃逸免疫殺傷，最終促進腫瘤發展〔21,22〕。Nozawa等〔6〕在胰腺瘤模型RIP1-Tag2小鼠中研究發現，在腫瘤血管的形成中，浸潤性中性粒細胞發揮著“起始開關”的作用。另外的研究者也報道了多種腫瘤組織血管的形成與中性粒細胞密切相關〔7〕。在黑色素瘤中，巨噬細胞可以通過產生有絲分裂原、生長因子、酶等促進腫瘤血管的生成，進而促進黑色素瘤細胞的生長和轉移〔23〕。Shi等〔24〕在臨床黑色素瘤組織中發現，黑色素瘤的惡性程度與浸潤性巨噬細胞的數量指數和血管分級程度呈正相關。因此，在腫瘤生長的微環境中，白細胞能夠分泌各種促血管生成的相關因子或直接參與血管形成，進而促進腫瘤血管的生成，最終促進腫瘤生長〔8〕；或者分泌金屬蛋白酶介質，從而促進腫瘤的侵襲和轉移〔9〕。

基因敲除動物是目前腫瘤功能基因研究中最理想的動物模型。運用基因打靶技術，將無功能的外源基因片段neo轉入細胞，與基因組中的同源序列Mac-1進行同源重組，從而把功能性的同源序列置換出來，造成Mac-1功能的完全缺失，最終得到Mac-1基因敲除小鼠〔25〕。Zhang等〔26〕研究報道，Mac-1缺失通過減少骨髓來源白細胞的募集抑制腸道腫瘤的生長。Ahn等〔27〕研究發現，特異性抗Mac-1的單克隆抗體可以抑制放療后的腫瘤生長而不會出現反跳現象。抑制Mac-1可以降低募集浸潤入腫瘤組織內的髓系白細胞數目，進而導致腫瘤血管生成障礙，血供營養不足，使腫瘤生長受到抑制。腫瘤細胞能夠分泌各種趨化因子，白細胞在趨化因子的趨化作用下從血管外滲，被募集浸潤入腫瘤組織內，進而為腫瘤生長和轉移提供幫助〔7〕。

綜上所述，Mac-1在腫瘤的生長和轉移中發揮著正向調控作用，Mac-1基因的缺失能夠抑制黑色素瘤的肺轉移。Mac-1基因缺失抑制黑色素瘤肺轉移可能是因為抑制了白細胞與血管內皮細胞的黏附功能，進而影響了白細胞的遷移和組織浸潤能力，但其作用機制還不明確，需要進一步探討。

1 Lefort CT,Hyun YM,Schultz JB,etal.Outside-in signal transmission by conformational changes in integrin Mac-1〔J〕.J Immunol,2009;183(10):6460-8.

2 Li N,Mao D,Lü S,etal.Distinct binding affinities of Mac-1 and LFA-1 in neutrophil activation〔J〕.J Immunol,2013;190(8):4371-81.

3 Tsutsui S,Yasuda K,Suzuki K,etal.Macrophage infiltration and its prognostic implications in breast cancer:the relationship with VEGF expression and microvessel density〔J〕.Oncol Rep,2005;14(2):425-31.

4 Wang FQ,So J,Reierstad S,etal.Matrilysin(MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase〔J〕.Int J Cancer,2005;114(1):19-31.

5 Hamada I,Kato M,Yamasaki T,etal.Clinical effects of tumor-associated macrophages and dendritic cells on renal cell carcinoma〔J〕.Anticancer Res,2002;22(6C):4281-4.

6 Nozawa H,Chiu C,Hanahan D.Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic switch in a mouse model of multistage carcinogenesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(33):12493-8.

7 Tazzyman S,Lewis CE,Murdoch C.Neutrophils:key mediators of tumour angiogenesis〔J〕.Int J Exp Pathol,2009;90(3):222-31.

8 Murdoch C,Muthana M,Coffelt SB,etal.The role of myeloid cells in the promotion of tumour angiogenesis〔J〕.Nat Rev Cancer,2008;8(8):618-31.

9 Joyce JA,Pollard JW.Microenvironmental regulation of metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer,2009;9(4):239-52.

10 覃冠平.黑色素瘤36例臨床病理分析〔J〕.吉林醫學,2011;32(21):4431.

11 李 海,鄭曉娟.惡性黑色素瘤21例臨床病理分析〔J〕.現代中西醫結合雜志,2012;21(3):272-3.

12 Ravdel L,Robinson WA,Lewis K,etal.Metastatic melanoma in the breast:a report of 27 cases〔J〕.J Surg Oncol,2006；94(2):101-4.

13 紀小龍,徐 薪,申明識.黏膜黑色素瘤的常見臨床病理特點〔J〕.診斷病理學雜志,2002;9(2):108-10.

14 全國腫瘤防治研究辦公室，全國腫瘤登記中心,衛生部疾病預防控制局.中國腫瘤登記年報2010〔M〕.北京:軍事醫學科學出版社,2011：80-1.

15 李 真,宋 鑫.黑色素瘤臨床研究進展〔J〕.實用腫瘤雜志,2014；29(1):1-6.

16 Gray-Schopfer V,Wellbrock C,Marais R.Melanoma biology and new targeted therapy〔J〕.Nature,2007；445(7130):851-7.

17 Garbea C,Eigentlera TK,Keilholz U,etal.Systematic review of medical treatment in melanoma:current status and future prospects〔J〕.Oncologist,2011；16(1):5-24.

18 Geng JG,Chen M,Chou KC.P-selectin cell adhesion molecule in inflammation,thrombosis,cancer growth and metastasis〔J〕.Curr Med Chem,2004；11(16):2153-60.

19 Languino LR,Duperray A,Joganic KJ,etal.Regulation of leukocyte-endothelium interaction and leukocyte transendothelial migration by intercellular adhesion molecule 1-fibrinogen recognition〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1995;92(5):1505-9.

20 Coussens LM,Werb Z.Inflammatory cells and cancer:think different〔J〕.J Exp Med,2001；193(6):23-6.

21 Obeid E,Nanda R,Fu YX,etal.The role of tumor-associated macrophages in breast cancer progression〔J〕.Int J Oncol,2013；43(1):5-12.

22 陳厚娣,夏先如,杜金鳳.ManLAM對免疫細胞的抑制作用〔J〕.安徽醫藥,2013;17(11):1968-70.

23 Torisu-Itakura H,Lee JH,Huynh Y,etal.Monocyte-derived IL-10 expression predicts prognosis of stage Ⅳ melanoma patients〔J〕.J Immunother,2007;30(8):831-8.

24 Shi L,Lei D,Ma C,etal.Clinicopathological implications of tumour-associated macrophages and vascularization in sinonasal melanoma〔J〕.J Int Med Res,2010;38(4):1276-86.

25 van Spriel AB,van Ojik HH,Bakker A,etal.Mac-1(CD11b/CD18) is crucial for effective Fc receptor-mediated immunity to melanoma〔J〕.Blood,2003;101(1):253-8.

26 Zhang QQ,Hu XW,Liu YL,etal.CD11b deficiency suppresses intestinal tumor growth by reducing myeloid cell recruitment〔J〕.Sci Rep,2015;5:15948.

27 Ahn GO,Tseng D,Liao CH,etal.Inhibition of Mac-1(CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(18):8363-8.

〔2016-11-14修回〕

(編輯 曲 莉)

Inhibitory effect of the gene deletion of Mac-1 on the lung metastasis of mouse melanoma

DUAN You-Fa, CHEN Jian, YE Zhi-Jin,etal.

Vascular Biology Research Institute, School of Basic Courses, Guangzhou Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

Objective To study the inhibitory effect of the gene deletion of Mac-1 on the lung metastasis of melanoma.Methods Mac-1 knockout mice were mated in order to obtain the number of need. Mice melanoma cells B16 were respectively injected into the caudal vein of the control group C57BL/6J mice and the experimental group Mac-1 knockout mice. The melanoma lung metastasis nodules were examined, survival rate of mice was counted, and micro metastases in lung tissue were observed by H&E.Results A large number of experiments with homozygous Mac-1 knockout mice (Mac-1-/-) were obtained by breeding expansion group. Compared with that of control group, the survival rate of Mac-1 knockout mice with intravenous B16 cells was significantly increased, and the lung nodule number was significantly reduced(P<0.001), and inhibition rate reached 75%, further through the lung tissue embedding, sectioning and H&E observation, tumor metastases of Mac-1 knockout mice was significantly reduced in the lung tissue.Conclusions The gene deletion of Mac-1 could significantly inhibite the lung metastasis of mouse melanoma.

Deletion of Mac-1; Melanoma; Lung metastasis

國家自然科學基金(No.31471290)；廣東省科技計劃(No.2015A030302083)；廣州市珠江科技新星(No.201610010045)；廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃(No.YQ2015100)

章倩倩(1981-)，女，副研究員，博士，主要從事腫瘤藥理、模式動物疾病模型研究。

段有發(1990-)，男，在讀碩士，主要從事腫瘤藥理、模式動物疾病模型研究。

R739.5

A

1005-9202(2017)09-2100-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.008