內(nèi)皮素-1在紅藻氨酸致癲癇大鼠海馬區(qū)的表達(dá)及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用

齊寶奎 臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

內(nèi)皮素-1在紅藻氨酸致癲癇大鼠海馬區(qū)的表達(dá)及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用

齊寶奎 臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的 觀察內(nèi)皮素(ET)-1在紅藻氨酸(KA)致癲癇大鼠海馬的表達(dá)及依達(dá)拉奉對(duì)其影響。方法 50只雄性 Wistar大鼠被隨機(jī)分成5組，每組10只。正常組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、癲癇組，治療組1(地西泮治療)，治療組2(地西泮+依達(dá)拉奉治療)。癲癇組在大鼠右側(cè)海馬以每公斤體重注射 1.5 μg/μl KA，PBS組采取同樣的方法在相同部位注入等量PBS，治療組1在癲癇模型成立后給予10 mg/kg地西泮終止癲癇，治療組2在治療組1的基礎(chǔ)上1 h后再給予依達(dá)拉奉30 mg，1次/12 h，正常組不注射任何藥物。結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡觀察，癲癇組ET-1的表達(dá)密度顯著高于PBS組及正常組(P<0.05)，治療組較正常組、PBS組及癲癇組表達(dá)顯著下降(P<0.05)，治療組1較治療組2表達(dá)顯著增高(P<0.05)。十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示ET-1的相對(duì)分子質(zhì)量為2 492 D，其在癲癇組的表達(dá)較正常組及PBS組顯著增加，治療組較癲癇組顯著降低(均P<0.05)，與激光共聚焦的結(jié)果相一致。結(jié)論 ET-1表達(dá)增加對(duì)癲癇后大鼠海馬的神經(jīng)元損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用。

癲癇；內(nèi)皮素(ET)-1；紅藻氨酸

癲癇是一種神經(jīng)元發(fā)作性異常放電所引起的以反復(fù)癇樣發(fā)作的臨床癥候群，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究發(fā)現(xiàn)30%～70%癲癇患者存在認(rèn)知功能障礙〔1，2〕。依達(dá)拉奉可清除自由基、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放。體內(nèi)許多組織中均有內(nèi)皮素(ET)分布，如血管平滑肌、心、腦神經(jīng)組織等，ET作為細(xì)胞內(nèi)信使在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)多種應(yīng)激狀態(tài)下可大量釋放，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)旨在研究癲癇狀態(tài)下?lián)p傷神經(jīng)元的ET-1的釋放表達(dá)及依達(dá)拉奉對(duì)其表達(dá)影響及其在顳葉癲癇發(fā)生及治療中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠50只，健康、雄性、清潔級(jí)，體重200～250 g，環(huán)境溫度適宜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。

1.2 癲癇大鼠模型的建立 隨機(jī)分成正常組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、癲癇組，治療組1(地西泮治療組)，治療組2(地西泮+依達(dá)拉奉治療組),每組10只。將Wistar大鼠用10%水合氯醛1 ml(0.3～0.4 ml/kg體重)麻醉后固定，備皮，切開(kāi)，剝離，按大鼠腦立體定向圖譜，以前囟為靶點(diǎn)定位CA3〔坐標(biāo)：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm〕鉆孔，將濃度為1.5 μg/μl紅藻氨酸(KA)(以PBS配制)1 μl，于無(wú)菌的條件下注入。注藥持續(xù)10～15 min，留針5 min。癲癇鼠模型的判定依據(jù)行為學(xué)改變。PBS組于相同部位等時(shí)注入等量的PBS。以Racine等〔3〕行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇模型。

1.3 標(biāo)本的制備 標(biāo)本固定，包埋，切片，脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，兔抗鼠ET-1抗體 (單克隆抗體)以1∶100的比例稀釋后于冰箱4℃孵育過(guò)夜，次日將切片室溫復(fù)溫1 h，反復(fù)3次PBS漂洗，滴加山羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記熒光二抗(濃度1∶50)，2.5 μg/ml碘化丙啶(PI)染色20 min后漂洗水化封片。從加熒光二抗開(kāi)始的雙重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需避光操作。所采用的雙標(biāo)法有參照Bernardini等〔4〕方法。

1.4 共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析 所用儀器為奧林巴斯LSM510 META共聚焦激光掃描生物顯微鏡。能同時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和514 nm可見(jiàn)光激光光源，發(fā)射波長(zhǎng)分別為516 nm與617 nm，兩者無(wú)交叉重疊區(qū)域，這種區(qū)分是進(jìn)行雙重標(biāo)記和觀察的前提。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，連續(xù)掃描10個(gè)層面。將數(shù)字化圖像存儲(chǔ)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析 提取細(xì)胞總蛋白，酶標(biāo)儀測(cè)總蛋白含量，樣品與5倍上樣緩沖液為4∶1，煮沸5 min使蛋白變性。步驟為：制備12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，取60 μg 總蛋白上樣，電泳30 min；室溫、恒壓220 V條件下，濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜〔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜〕30 min。37℃于封閉液中封閉2 h；封閉液以吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)配制加5%脫脂奶粉，ET-1抗體(1∶50)4℃冰箱孵育過(guò)夜；反復(fù)吐溫Tris-緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次，10 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-抗兔IgG(1∶8 000)于室溫?fù)u床中孵育2 h，反復(fù)TBST 洗3次，每次5～10 min；電化學(xué)反應(yīng)(ECL)反應(yīng)30 min后，暗室中X線片曝光；室溫顯影、定影。用凝膠圖像系統(tǒng)(GIS)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行薄層密度掃描，記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度(IOD)值反映蛋白含量。β-actin為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫印跡法癲癇組海馬CA3區(qū)蛋白的表達(dá) 癲癇組ET-1表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

1.正常組，2.PBS組，3.癲癇組，4.治療組1，5.治療組2 圖1 ET-1在大鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)

2.2 各組海馬CA3區(qū)蛋白的表達(dá) 當(dāng)開(kāi)檢測(cè)通道為488 nm時(shí)，僅顯示被染成綠色熒光的光斑(圖2中1、4、7、10、13)，而當(dāng)開(kāi)檢測(cè)通道為514 nm時(shí)，僅顯示被染成紅色的核酸(圖2中2、5、8、11、14)，這樣更加清楚地顯示了細(xì)胞核的輪廓，當(dāng)細(xì)胞核PI標(biāo)記的核酸紅色與細(xì)胞外FITC標(biāo)記的熒光二抗綠色疊加時(shí)，更能突顯細(xì)胞質(zhì)中所觀測(cè)蛋白的表達(dá)(圖2中3、6、9、12、15)。在CA3區(qū)，ET-1的表達(dá)密度癲癇組(4.08±0.30)顯著高于正常組(0.98±0.03)及PBS組(1.04±0.04)，治療組顯著低于癲癇組，治療組1(2.01±0.22)顯著高于治療組2(1.30±0.15)(均P<0.05)。

1～3為正常組，4～6為PBS組，7～9為癲癇組，10～12為治療組1，13～15為治療組2 圖2 免疫熒光雙染法測(cè)ET-1在各組大鼠海馬的表達(dá)(×200)

3 討 論

KA致癲模型已得到廣泛認(rèn)可，具有很強(qiáng)神經(jīng)毒性的KA作為谷氨酸類似物的一種，可人工提取，它可與非N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合，此種作用發(fā)生于神經(jīng)元突觸后膜上。目前認(rèn)為興奮性氨基酸的堆積和海馬神經(jīng)元興奮性氨基酸受體的上調(diào)是KA誘導(dǎo)癇性發(fā)作的主要分子機(jī)制〔5〕。海馬 CA3區(qū)神經(jīng)元死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生和苔狀纖維發(fā)芽是海人酸顳葉癲癇模型一個(gè)顯著的病理特點(diǎn)，這樣的病理改變同人類顳葉癲癇的病理改變與海馬硬化相一致〔6〕。

ET-1作為ET家族中的一員，是目前已知的最強(qiáng)的縮血管肽，是CNS一個(gè)重要的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽，它可與其受體結(jié)合，激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，并通過(guò)Na+/ Ca2+交換機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加。研究表明鈣通道參與癲癇形成〔7～9〕，Ca2+過(guò)度內(nèi)流所致鈣通道異常，從而腦神經(jīng)元的過(guò)度、同步放電，致其發(fā)作。癲癇患者鈣通道異常，致Ca2+過(guò)度內(nèi)流，神經(jīng)元異常放電，采用地西泮及依達(dá)拉奉的聯(lián)合治療致ET-1的表達(dá)改變，從而干預(yù)鈣通道，而對(duì)異常放電的神經(jīng)元起到保護(hù)作用。其可能的作用機(jī)制是依達(dá)拉奉可降低谷氨酸的興奮性，而二者的聯(lián)合使用是序貫使用，不是混合應(yīng)用，故不考慮二者混合應(yīng)用會(huì)對(duì)大鼠造成不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)二者的聯(lián)合應(yīng)用不受此影響。至于依達(dá)拉奉清除自由基的作用是否起到此作用，有待研究確定。依達(dá)拉奉可清除羥自由基，對(duì)腦神經(jīng)元具有保護(hù)作用(約60%可以透過(guò)血腦屏障)，其可抑制谷氨酸釋放，且可拮抗氧自由基，也可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。依達(dá)拉奉為小分子，靜脈用藥能夠在腦內(nèi)到達(dá)有效治療濃度〔10，11〕。神經(jīng)科中已廣泛應(yīng)用依達(dá)拉奉注射液的羥自由基清除劑功能〔12〕。 Kamida 等〔10〕究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉在癲癇中所起的保護(hù)作用是通過(guò)降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)而減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H201498)

臧兆萍(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事癲癇研究。

齊寶奎(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病與癲癇研究。

R742.1

A

1005-9202(2017)09-2105-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.010