Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調節海馬神經細胞凋亡中的作用

呂 路 梅 蕊 彭 樊 王 昉 王 婧

(武漢市精神衛生中心醫務處，湖北 武漢 430022)

Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調節海馬神經細胞凋亡中的作用

呂 路 梅 蕊 彭 樊1王 昉2王 婧3

(武漢市精神衛生中心醫務處，湖北 武漢 430022)

目的 探討非典型性抗精神病藥物阿立哌唑是否通過Akt信號通路對海馬神經細胞的凋亡發揮作用。方法 通過構建精神分裂癥(CPZ)模型小鼠，設置對照組、阿立哌唑組、CPZ組、CPZ+阿立哌唑四組，實驗結束后對小鼠斷頭取腦，冰上分離出海馬組織和脊髓，培養海馬神經細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，MTT檢測細胞增殖、Western印跡檢測自噬相關蛋白Beclin1的表達情況；使用磷酸化Akt信號通路試劑盒對總Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的變化情況進行檢測。結果 對飼養6 w后的小鼠提取海馬神經細胞，流式細胞儀、MTT檢測結果表明，建立CPZ模型的小鼠，在飼養過程中使用阿立哌唑能明顯降低海馬神經細胞的凋亡率；MTT檢測結果表明，與對照組相比，使用阿立哌唑的CPZ模型小鼠海馬神經細胞的存活率明顯提高(P<0.01)；Western印跡檢測自噬相關蛋白Beclin1的結果表明，構建的CPZ模型小鼠脊髓受到一定程度損傷，Beclin1的表達量明顯升高(P<0.01)，給阿立哌唑后其表達量顯著下降；在CPZ組中總Akt及Ser473的表達水平均顯著下降(P<0.01)，通過服用阿立哌唑后表達水平出現回升，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結論 非典型性抗精神病藥物阿立哌唑可通過Akt信號通路使海馬神經細胞免于凋亡。

阿立哌唑；Akt信號通路

抑郁癥主要是由于認知與現實的不協調造成的，其癥狀的輕重程度與環境及受教育程度密切相關〔1,2〕。目前，藥物治療仍作為該病的首選方式〔2〕。與傳統抗精神病藥物相比，非典型性抗精神病藥物療效好，副作用小，已被廣泛應用于臨床治療〔3〕。磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白酶B(PI3K/Akt)信號通路作為一種促生存信號通路，其激活對神經細胞的保護具有重要作用，從而起到緩解抑郁癥狀的作用〔4〕。本研究通過構建精神分裂癥(CPZ)模型小鼠，觀察非典型性抗精神病藥物阿立哌唑是否通過PI3K/Akt信號通路發揮抗抑郁癥的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及動物模型的制備 實驗所用小鼠均購自武漢大學實驗動物中心，6～7周齡，體重(18±2)g。購買之后常規飼養7 d，飼養環境的溫度約23.5℃、濕度控制在40%～60%。

動物模型的制備:采用0.2%質量濃度的 cuprizone 連續給藥6 w構建CPZ。具體制作方法：將CPZ按照0.2%的添加量與飼料混勻，用自來水使之混合凝結成團狀，用模具制成圓柱狀小鼠顆粒飼料，于陰涼通風處烘干，使用該飼料飼喂小鼠6 w即可。

1.2 實驗藥物 阿立哌唑。

1.3 主要儀器和試劑 胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司),RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),蛋白質提取試劑盒(上海純優生物科技有限公司),BCA蛋白質濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),反轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司),實時定量PCR試劑盒(上海信帆生物科技有限公司),磷酸化Akt信號通路試劑盒(Cell Signaling),Annexin-V-FTTC-P1試劑盒(美國Coulter),MTT(美國Invitrogen),流式細胞儀(美國Coulter),離心機(Eppendorf),CO2培養箱(長沙長錦生物科技有限公司),超凈工作臺(無錫云潔凈化設備有限公司),倒置顯微鏡(日本尼康),熒光素酶分析儀(北京普力特儀器有限公司),離心機(德國Sorvall)。

1.4 實驗分組 分為對照組、阿立哌唑組、CPZ組、CPZ+阿立哌唑組，其中對照組常規飼養，阿立哌唑組在常規飼養過程中通過飲水飼喂阿立哌唑，CPZ組在建模過程中飼喂0.2%質量濃度的CPZ；CPZ+阿立哌唑組在建模過程中飼喂0.2%質量濃度的CPZ，同時飲水服用阿立哌唑(10 mg/d)。實驗周期為6 w。

1.5 海馬細胞培養 6 w后，分別對各組小鼠斷頭取腦，冰上分離出海馬組織，0.25%的胰酶對海馬組織消化15 min，并吹打均勻，制成單細胞懸液。隨后對單細胞懸液進行過濾，細胞計數后分裝入含有10%胎牛血清的培養瓶中，37℃飽和濕度、5%CO2條件下進行常規傳代培養。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 0.25%的胰蛋白酶消化收集海馬細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗后加入5 μl膜聯蛋白(Annexin V)，室溫條件下孵育10～15 min后加入5 μl 7-AAD，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 MTT檢測細胞增殖情況 收集處于對數生長期的細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，接種于96孔細胞培養板中過夜培養至48 h。加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml)，37℃培養4 h，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl震蕩，待沉淀完全溶解后置于酶標儀測定OD值。

1.8 Western印跡檢測Akt信號通路的變化 通過使用磷酸化Akt信號通路試劑盒對總Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的變化情況進行檢測，分別對其總蛋白進行提取，提取方法參照說明書進行。將蛋白樣品與上樣緩沖液以3∶1的比例混合，100℃煮沸5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)檢測。電壓采用先低后高的趨勢，以保證條帶的質量，當Marker遷移至分離膠底部時終止電泳。取出凝膠在4℃條件下轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗4℃孵育過夜，Trist鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后與兔抗小鼠二抗室溫孵育1 h。用增強化學發光法(ECL)顯影后成像。

1.9 Western印跡檢測自噬相關蛋白Beclin1的表達 6 w后采用頸部處死的方式，分別取出各組小鼠的脊髓：快速暴露損傷部位的脊髓，在無菌條件下取出小塊損傷的脊髓并置于液氮中保存。隨后參照蛋白提取試劑盒說明書，分別對各組的脊髓相關蛋白Beclin1進行提取，采用紫外分光光度計測定蛋白含量，并通過Western印跡進行檢測。

1.10 統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測海馬神經細胞的凋亡情況 建立CPZ模型小鼠，在飼養過程中使用阿立哌唑能明顯降低海馬神經細胞的凋亡率；而在對照組和阿立哌唑組效果不顯著。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

2.2 MTT檢測細胞增殖情況 對照組〔(78.16±4.64)%〕和阿立哌唑組〔(79.82±6.31)%〕海馬細胞存活情況大致一致，差異無統計學意義(P>0.05)；但CPZ模型小鼠海馬神經細胞的存活率〔(29.64±2.56)%〕明顯下降，服用阿立哌唑后細胞存活率〔(62.47±1.64)%〕明顯升高(P<0.01)。

2.3 Beclin1的表達情況 構建的CPZ模型的小鼠脊髓受到一定程度損傷，Beclin1表達量明顯升高(對照組為0.53±0.05,CPZ組為0.84±0.06，阿立哌唑組為0.52±0.04，P<0.01)，給予阿立哌唑后表達量(0.46±0.07)顯著下降，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 Western印跡檢測Akt信號通路的變化情況 總Akt 及Ser473表達水平的變化情況基本一致，CPZ組中兩者的表達水平(0.63±0.08，0.79±0.06)均顯著下降(P<0.01)，服用阿立哌唑后表達水平出現回升(1.75±0.17，1.48±0.10)，與對照組(1.62±0.11,1.73±0.13)相比差異無統計學意義(P>0.05)。阿立哌唑組總Akt、Ser473表達量分別為2.25±0.16，1.94±0.12。

3 討 論

非典型性抗精神病藥物作為治療抑郁癥的首選，治療效果較好，且副作用小，具有很好的應用前景〔5～7〕，其作用機制為：(1)可能限制了黑質紋狀體通路的5-羥色胺(5-HT)2A受體，使紋狀體D2受體功能的選擇性得以改善，并通過阻斷中腦皮層通路，增加了前額皮層的D1 受體功能。(2)通過阻斷中腦邊緣系統的D2 受體,調節多巴胺功能亢進,使注意力得到改進。阿立哌唑是首個用于治療抑郁癥的D2 受體拮抗劑，主要是通過拮抗多巴胺D2 受體的活性進行介導的。前期研究結果表明，在CPZ患者中，阿立哌唑較氯丙嗪的治療效果好〔8〕。研究報道〔9〕，抑郁癥患者中，海馬神經元明顯減少，進一步研究證實，重癥CPZ患者的海馬體積顯著縮小，推測這與海馬神經元的凋亡密切相關。PI3K/Akt信號通路在細胞中廣泛存在，主要參與細胞的分化、增殖、凋亡等過程，作為一種促生存信號通路，其激活對神經細胞的保護具有重要作用〔10〕。Akt即蛋白激酶B，作為PI3K的靶蛋白之一，其特異性與底物中絲氨酸(蘇氨酸)殘基相互作用，使其磷酸化，從而在蛋白質的相互作用間起作用。Ser-473作為主要的磷酸化位點，其表達量的升高預示著PI3K/Akt信號通路的激活，從而保護細胞免于凋亡。本研究結果表明，對CPZ模型的小鼠使用阿立哌唑后，總Akt及Ser-473的表達量明顯回升。后續對海馬細胞的凋亡情況及細胞存活率研究表明，與CPZ組的小鼠相比，服用阿立哌唑的CPZ模型組的小鼠，海馬細胞的存活率明顯提高、凋亡率明顯降低。提示阿立哌唑可通過激活PI3K/Akt信號通路，從而使海馬神經細胞免于凋亡。

抑郁癥患者會伴隨不同程度的脊髓損傷，脊髓損傷會導致自噬現象的發生，而自噬在海馬神經細胞的發生發展過程中發揮中藥作用，可作為細胞的保護機制，防治細胞凋亡〔11〕。Beclin1作為一種自噬相關蛋白，能夠促進自噬的發生，且在脊髓損傷后Beclin1的表達量顯著增高〔12〕。Beclin1在神經元和膠質細胞中呈現高表達，這在一定程度上促進了自噬現象的激活，這對細胞凋亡的抑制具有促進作用。本研究表明阿立哌唑對抑郁癥的小鼠具有一定的緩解作用。由于本文僅研究單一的非典型性抗精神病藥物通過Akt信號通路對海馬神經細胞的作用，但就其一類藥物中的其他藥物是否都是通過Akt信號通路發揮作用及其具體的作用機制還有待深入研究。

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7 Kaneko YS,Takayanagi T,Nagasaki H,etal.Aripiprazole increases NAD(P)H-quinone oxidoreductase-1 and heme oxygenase-1 in PC12 cells〔J〕.J Neural Transmis,2015；122(6):757-72.

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11 黃 蓉,韋 曦.自噬效應蛋白Beclin1的研究進展〔J〕.中外醫學研究,2011;9(28):159-61.

12 Kuo SY,Castoreno AB,Aldrich LN,etal.Small-molecule enhancers of autophagy modulate cellular disease phenotypes suggested by human genetics〔J〕.Proceed Nat Acad Sci,2015;112(31):E4281-7.

〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

湖南省自然科學基金(No.2015JJ1010)

王 昉(1980-)，女，主治醫師，主要從事精神疾病方面研究。

呂 路(1978-)，男，主治醫師，主要從事精神疾病方面研究。

R749.05

A

1005-9202(2017)09-2110-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.012

1 武漢市中醫醫院院辦 2 武漢市精神衛生中心司法鑒定科

3 武漢市精神衛生中心綜合科