不同膝關節骨性關節炎模型大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的比較

吳向陽 柳奇奇 汪宗保 盧陶陶 喬曉迪 段文秀 廖艷芳 楊艷軍 徐亞林

(安徽中醫藥大學針灸骨傷臨床學院，安徽 合肥 230038)

不同膝關節骨性關節炎模型大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的比較

吳向陽 柳奇奇 汪宗保 盧陶陶 喬曉迪 段文秀1廖艷芳 楊艷軍 徐亞林2

(安徽中醫藥大學針灸骨傷臨床學院，安徽 合肥 230038)

目的 采取2%木瓜蛋白酶溶液關節腔注射和手術造成關節不穩兩種方法誘導大鼠膝關節骨性關節炎(KOA)模型，比較兩種造模方法在不同時間節點關節軟骨Ⅱ型膠原表達的異同。方法 54只8周齡SD大鼠按體重分層后隨機分為3組，每組18只。手術組手術切除大鼠右膝內側半月板、切斷內側副韌帶誘導KOA；藥物組通過在大鼠右膝關節腔注射2%木瓜蛋白酶溶液誘導KOA；對照組常規飼養。于造模后第4、6、8周取右膝股骨內側髁關節軟骨，行免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原表達。結果 造模后第4、6、8周，手術組和藥物組軟骨細胞Ⅱ膠原表達逐漸減低，軟骨表面缺損，與對照組相比有統計學差異(P<0.05)。手術組關節軟骨Ⅱ型膠原表達與藥物組比較無統計學差異(P>0.05)。結論 手術切除膝關節內側半月板、切斷內側副韌帶和關節腔注射木瓜蛋白酶溶液是KOA的理想造模方法，在第4、6、8周關節軟骨Ⅱ型膠原表達逐漸減少，Ⅱ型膠原的表達手術組與藥物組比較無統計學差異。實驗可根據個體需要，做出科學地選擇。

膝骨關節炎；木瓜蛋白酶；手術；Ⅱ型膠原

骨性關節炎(OA)在老年人群中極為常見，流行病學調查顯示〔1～4〕，老年人、肥胖者、有膝關節創傷病史者多發。選擇合適的造模方法是成功開展OA防治研究的重要前提。 研究表明，Ⅱ型膠原是一種與關節軟骨退變有密切聯系的細胞外基質中的膠原的主要成分(含量占總膠原量的90%～95%)，在促進組織損傷后的再生和修復方面具有重要作用〔5〕，關節軟骨正常生物力學的改變，常繼發于細胞外基質中膠原、蛋白聚糖質和量的改變，繼而生物力學的改變逐漸演變為軟骨退變、關節邊緣骨贅形成和軟骨下骨反應性增生等病理變化〔6〕。實驗證明，膝關節腔內注射2%木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合溶液、手術切除大鼠膝關節內側半月板、切斷內側副韌帶是切實可行的造模方法〔7～9〕。既往也有不少對不同濃度木瓜蛋白酶造模研究的報道，但對于藥物關節腔內注射和關節不穩這兩種造模方法的對比研究卻報道極少。本實驗將藥物造模和手術造模產生的膝關節OA(KOA)關節軟骨Ⅱ型膠原表達的變化進行對比，旨在為實驗研究選取合適的模型提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、藥物和試劑 SD大鼠(安徽省實驗動物中心)批號scxk(皖)2011-002；Ⅱ型膠原一抗(北京博奧森生物技術有限公司)批號130717w；Ⅱ型膠原二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)批號K142318B；木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸(美國Sigma公司)；鹽酸曲馬多注射液(歐洲麥道甘美大藥廠)批號AM06AB；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)批號F3076112。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物和分組方法 選取健康8周齡雄性SD大鼠54只，按體重分層后隨機分為手術組、藥物組、對照組，每組18只，常規飼養1 w后進行手術和關節腔注射。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 藥物組 木瓜蛋白酶關節腔注射建立大鼠KOA模型。 在無菌條件下用0.9%氯化鈉溶液配制2%(W/V)木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液，于4℃恒溫冰箱儲存，至實驗前4 h取出室溫放置，注射前30 min將 2% 的木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液按2∶1的比例混勻。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，麻醉成功后雙膝關節備皮、消毒、屈曲約45°，從髕骨下緣前內側的膝眼向髁間窩方向進針，明顯有落空感后，針尖抵達股骨內側髁再回撤2 mm，注入2%木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸的混合溶液0.15 ml至右側膝關節腔。左側膝關節腔同樣方法注射0.15 ml生理鹽水對照。實驗開始后第4、7天分別再注射1次。

1.2.2.2 手術組 以關節不穩建立大鼠KOA模型。器械滅菌，鋪好無菌手術單(長40 cm、寬60 cm)，將大鼠按3 ml/kg水合氯醛腹腔內注射麻醉，選取右膝關節，膝關節上下1.5 cm范圍備皮、碘伏消毒、75%酒精脫碘，鋪巾。在髕韌帶內側取長約0.5 cm切口，鈍性分離軟組織后切開關節囊，將髕骨向外側脫位，分離并切除內側半月板、分離并切斷內側副韌帶。髕骨復位，關閉關節囊，縫合手術切口。對側膝關節打開關節囊后不行內側副韌帶切斷和內側半月板切除，關閉關節囊，縫合手術切口。術后肌注青霉素鈉1 ml預防感染、1 ml噴灑于傷口，大鼠麻醉清醒后肌注鹽酸曲馬多注射液鎮痛。術后分籠飼養，切口愈合良好無滲出。

1.2.3 取材和標本處理 分別在第4、6、8周取材大鼠右膝關節股骨內側髁關節軟骨，4%甲醛溶液固定1 d，10%EDTA溶液對所取標本脫鈣，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟過液，石蠟包埋、切成4 μm厚的切片，免疫組化染色，中性樹膠封片，觀察。

1.3 觀察指標

1.3.1 改良Mankin評分 光鏡下觀察改良Mankin評分，并根據評分對KOA標本進行病理學分期：0～1分為正常，2～5分為早期，6～9分為中期，10～14分為晚期。

1.3.2 觀察Ⅱ型膠原的表達 分別在第4、6、8周觀察大鼠右腿股骨內側髁形態改變和關節表面變化，對每張切片選取4個不同的視野，放大400倍觀察軟骨基質中Ⅱ型膠原的表達。

1.4 統計學方法 采用 SPSS17.0 統計軟件進行單因素方差分析及秩和檢驗。

2 結 果

2.1 光鏡下觀察改良Mankin評分 藥物組大鼠第4周處于KOA早期，第6周處于KOA早期、中期過渡時間，第8周處于KOA中期；手術組大鼠第4周處于KOA早期，第6周處于KOA早期、中期過渡時間，第8周處于KOA中期。藥物組與手術組大鼠Mankin評分相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩種造模方法不同時間節點KOA大鼠改良Mankin評分

與同期對照組比較：1)P<0.05

2.2 各組膝關節軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達 正常關節軟骨從關節面到軟骨下骨、軟骨基質都是均一和完整的。軟骨基質中度、深度著色；接近關節表面的軟骨細胞較小；軟骨中層或深層的軟骨細胞則較大。對照組Ⅱ型膠原表達正常，軟骨面呈均勻的褐色，細胞周圍均勻的包裹大量淡褐色區域。藥物組和手術組第4周軟骨細胞分布不均勻，Ⅱ型膠原表達減少，著色不均勻。第6周藥物組和手術組軟骨細胞周圍Ⅱ型膠原著色不規則且大量減少，手術組軟骨表面欠光滑。至第8周，藥物組與手術組軟骨表面均有缺損，Ⅱ型膠原表達極少。見圖1，圖2。

圖1 手術組Ⅱ型膠原在不同時間節點的表達(DAB，×400)

圖2 藥物組Ⅱ型膠原在不同時間節點的表達(DAB，×400)

3 討 論

關節軟骨的細胞外基質除水外主要是膠原和蛋白聚糖。在幾種遺傳學上不同的膠原中，Ⅱ型膠原是關節軟骨的主要成分和張力的決定性因素，Ⅱ型膠原的減少直接導致軟骨的受力發生變化〔10～14〕。研究認為，人類OA軟骨最早發生的顯著變化之一是水分的增加和蛋白多糖的減少〔15〕。研究OA的動物模型制備方法對動物的選擇很廣泛，有大鼠、兔、豬、羊等〔16～20〕。而大鼠具有基因與人類類似、價廉且易飼養等優點，故被經常用于制作OA動物模型。

木瓜蛋白酶對動植物蛋白具有較強的水解能力，其誘導大鼠KOA具有成功率高、時間短、重復性好等特點。與韓冠英等〔21〕選用不同濃度木瓜蛋白酶誘導KOA的做法不同，本研究采用的木瓜蛋白酶溶液濃度相對較低，注射的是木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸溶解成2%的木瓜蛋白酶與0.03 mol/L 的 L-半胱氨酸的混合溶液。手術法復制OA模型的重點在于破壞關節的穩定性，造成膝關節的生物力學紊亂，具有成功率高、效果切實可靠、時間短等優點。膝關節不穩后會使關節軟骨產生肥厚性表現、膠原網消失。初始階段是軟骨蛋白聚糖合成增加、膠原減少，其后軟骨基質循環加快，只消耗重要成分軟骨基質。Hayami等〔22,23〕研究證明半月板具有吸收震蕩、分布負荷和延伸關節滑液等作用。膝關節是人體最大最復雜的受力關節，在關節軟組織的損傷后如果沒有得到足夠的修復，常發展為創傷性關節炎。Stoop等〔24〕通過手術造成關節不穩建立大鼠膝關節OA，發現早期即有關節軟骨的Ⅱ型膠原裂解產物增多。基質金屬蛋白酶(MMPs)在軟骨基質大分子的裂解過程中起主要作用(主要是膠原酶3，即MMP-13)，在OA時，各種MMPs的含量表達增高，由于Ⅱ型膠原是被膠原酶裂解變性的，Ⅱ型膠原裂解也明顯增加。這種裂解最先發生于健康關節軟骨淺表部位的軟骨細胞周圍，繼之發展到整個關節軟骨層。雖然OA時，Ⅱ型膠原的合成是顯著增加的，但是原有的和新合成的Ⅱ型膠原都在被裂解，這種增加不足以抵消MMPs對它的裂解。

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〔2015-01-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

中國博士后基金項目(No.2011M501355)；安徽省自然科學基金項目(No.1508085MH181)；安徽中醫藥大學省級大學生創新創業訓練項目(No.2014048)

汪宗保(1973-)，男，主治醫師，副教授，碩士生導師，臨床醫學博士后，主要從事運動醫學研究。 徐亞林(1970-)，男，主任醫師，碩士生導師，臨床醫學博士后，主要從事康復醫學研究。

吳向陽(1992-)，男，主要從事骨關節炎的針灸、康復療法研究。

R274

A

1005-9202(2017)09-2114-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.014

1 安徽中醫藥大學研究生部

2 廣東醫學院附屬開平醫院康復醫學科