他汀類藥物對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥及黏液高分泌的作用及機制

柳國洪 于洪江

(白城醫(yī)學高等專科學校，吉林 白城 137000)

他汀類藥物對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥及黏液高分泌的作用及機制

柳國洪 于洪江

(白城醫(yī)學高等專科學校，吉林 白城 137000)

目的 探討他汀類藥物對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠氣道炎癥及黏液高分泌的作用及機制。方法 通過煙熏和氣管注入脂多糖建立大鼠COPD模型。將21只SD大鼠隨機分為對照組、COPD組、辛伐他汀組，每組7只。對照組、COPD組每日用生理鹽水灌胃1次，劑量為1 ml/100 g；辛伐他汀組每日用0.5 g/L的辛伐他汀溶液按1 ml/100 g劑量灌胃1次。檢測大鼠肺功能指標，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察支氣管和肺組織的病理變化；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)上清液中細胞因子白細胞介素(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量；免疫組化法檢測肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、Toll樣受體(TLR)4的表達；Western印跡和RT-PCR檢測肺組織黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA的表達。結(jié)果 辛伐他汀組大鼠肺功能指標明顯高于COPD組，低于對照組(P<0.01)；辛伐他汀組大鼠病理學改變較COPD組明顯減輕。COPD組大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯高于辛伐他汀組和對照組，辛伐他汀組明顯高于對照組(P<0.01)。COPD組、辛伐他汀組大鼠肺組織中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4水平均明顯高于對照組而低于COPD組(P<0.01)。COPD組大鼠組織黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表達量均明顯高于對照組，辛伐他汀組明顯低于COPD組(P<0.01)；辛伐他汀組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 辛伐他汀可有效降低COPD大鼠的氣道炎性反應，抑制氣道黏液高分泌，主要通過抑制NF-κB下游信號通路和TLR4/NF-κB信號通路來實現(xiàn)。

辛伐他汀；慢性阻塞性肺疾病；氣道炎癥；氣道黏液高分泌

慢性阻塞性肺疾病(COPD)多發(fā)于老年人群〔1〕。近年來氣道炎癥和黏液高分泌在COPD發(fā)病中的作用成為研究熱點之一；氣道中炎性細胞浸潤可增加黏液分泌量，進而加重炎癥反應，被認為與COPD病情進展密切相關〔2〕。他汀類藥物是中國治療心血管疾病的一線藥物，但其在調(diào)節(jié)血脂之外還有抗感染、調(diào)節(jié)細胞凋亡等作用〔3〕。本研究旨在探討他汀類藥物對COPD氣道炎癥和黏液高分泌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物和材料 雄性SD大鼠21只，7～10周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心，批號：SCXK(吉)2003004。辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字H19990366)；脂多糖，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京中生瑞泰科技有限公司)；大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB單克隆抗體，大鼠黏蛋白5AC單克隆抗體(上海蜜駿生物科技有限公司)；兔抗大鼠黏附分子1、Toll樣受體(TLR)4多克隆抗體(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為對照組、COPD組、辛伐他汀組，每組7只。按照文獻的方法建立大鼠COPD模型〔4〕。對照組、COPD組用1 mg/100 g生理鹽水灌胃，1次/d；辛伐他汀組用0.5 g/L的辛伐他汀溶液按1 ml/100 g劑量灌胃，1次/d，辛伐他汀給藥量按成年人用量0.5 mg/kg每日換算大鼠給藥量，是臨床用量的10倍。分別在第29、42天腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，用靜脈套管針插入大鼠氣管注入100 μg/100 μl的脂多糖，第30～56天(排除第42天)上午均將大鼠放入密封煙室中，連續(xù)吸入香煙煙霧45 min，1次/d，20支/次，對照組除外。3組大鼠除煙熏外，其余時間均在相同環(huán)境喂養(yǎng)，第57天處死。

1.2.2 肺功能檢測 使用意大利科時邁動物肺功能儀PONY FX檢測。造模最后1 d，麻醉后分組將大鼠固定，切開頸部皮膚，分離皮下組織，在氣管軟骨間做一小切口，插入接有三通的氣管插管，切口下端縫合固定后將插管另一側(cè)接入呼吸機。測定肺活量(FVC)、0.1 s用力呼氣量(FEV0.1)、呼氣峰值流速(PEF)。

1.2.3 肺組織病理學檢查和細胞因子含量測定 肺功能測完后打開胸腔，切取2葉左肺，凍存待測。用注射器將5 ml生理鹽水注入氣管，反復抽吸3次后回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，反復操作3次，收集BALF約8 ml，1 000 r/min離心20 min，收集上清，凍存待測。取出右肺，經(jīng)10%甲醛固定后，石蠟包埋，0.4 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，免疫組化法觀察組織病理學改變。ELISA法檢測BALF上清液中細胞因子白細胞介素(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4 免疫組化檢測 采用免疫組化SP法檢測大鼠肺組織中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4表達水平。取右下肺組織切片，按試劑盒說明，分別加入相應一抗的濃度均為1∶500，冷藏過夜，加二抗，37℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察；IPP分析軟件測定陽性細胞的吸光度。

1.2.5 Western印跡檢測 Western印跡法檢測肺組織中黏蛋白5AC、TLR4的蛋白表達水平，取收集的左肺組織100 mg，蛋白裂解后1 200 r/min離心15 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。將獲取的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將目標蛋白濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，分別滴加鼠抗人黏附分子5AC單克隆抗體、鼠抗人TLR4單克隆抗體，4℃過夜，磷酸緩沖液(PBS)洗滌后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下封閉2 h，PBS洗滌后使用化學發(fā)光增強法(ECL)發(fā)光試劑盒檢測蛋白水平，軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算目的條帶的相對比值。

1.2.6 RT-PCR檢測 取左肺組織100 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應體系共10 μl(SYBR Green 熒光定量染料5 μl、上游和下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、蒸餾水2 μl)。常規(guī)反應條件下共進行40個循環(huán)，引物由上海依赫生物科技有限公司。使用2-△△Ct法計算定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠肺功能指標比較 辛伐他汀組大鼠肺功能明顯高于COPD組，低于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠肺功能指標比較

與對照組比較：1)P<0.01；與COPD組比較：2)P<0.01；下表同

2.2 3組大鼠肺組織病理學改變 對照組無支氣管壁增厚和炎性細胞浸潤，肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，無纖毛脫離。COPD組支氣管壁增高，血管周圍存在炎性細胞浸潤，肺泡組織壁變薄，相互融合，明顯纖毛脫落、倒伏，符合COPD的病理表現(xiàn)。辛伐他汀組支氣管壁厚度輕度增加，管腔局部變形，血管周圍輕度炎性細胞浸潤，肺泡組織部分纖毛脫落、倒狀。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織病理學變化(HE，×200)

2.3 3組大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α水平比較 COPD組大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯高于辛伐他汀組和對照組，辛伐他汀組明顯高于對照組(P<0.01)。見表2。

2.4 3組大鼠肺組織NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4表達水平比較 COPD組、辛伐他汀組大鼠肺組織中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4水平均明顯高于對照組而明顯低于COPD組(P<0.01)。見表3。

表2 3組大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α水平比較

表3 3組大鼠肺組織中檢測指標比較±s,n=7)

2.5 3組大鼠肺組織黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表達水平比較 COPD組大鼠組織黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表達量均明顯高于對照組，辛伐他汀組明顯低于COPD組(P<0.01)；辛伐他汀組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組大鼠肺組織黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表達量比較

3 討 論

本研究中采用煙熏結(jié)合氣管輸注脂多糖來大鼠COPD模型，并提示造模成功，且結(jié)果說明辛伐他汀可能對COPD具有防治作用。

黏附分子1多由血管內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞分泌，其高表達與COPD氣道炎性細胞增加和黏液大量生成有關。NF-κB是一種具有多種調(diào)節(jié)作用的因子，可在基因水平上調(diào)控多種炎性介質(zhì)，自身也能夠?qū)F-κB激活，進而提升炎性反應介質(zhì)相關基因表達，產(chǎn)生級聯(lián)效應〔5〕。本研究結(jié)果提示辛伐他汀可通過抑制NF-κB的活性使下游信號通路的活性喪失，減少炎性介質(zhì)的分泌，改善COPD的氣道炎性反應。

TLR4是一種病原識別受體，脂多糖與其結(jié)合可激活Toll樣受體，使NF-κB通路開放，促進炎性因子的大量釋放〔6〕。相關研究顯示，黏蛋白5AC高分泌與TLR4/NF-κB信號通路的高表達有關〔7〕。本研究結(jié)果說明辛伐他汀可有效治療COPD大鼠氣道黏液的高分泌作用，主要通過降低TLR4表達來抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性，進而降低黏蛋白5AC表達水平來實現(xiàn)。

1 洪秀琴，戴愛國，孔春初，等.湖南部分地區(qū)慢性阻塞性肺疾病流行現(xiàn)狀調(diào)查〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(4)：795-7.

2 Reed RM,Scharf S.Increased adverse events after percutaneous coronary intervention in patients with COPD〔J〕.Chest，2012；141(3)：828-9.

3 王 偉.辛伐他汀對COPD氣道炎癥和細胞凋亡的影響及其機制研究〔D〕.蘇州：蘇州大學，2012.

4 Wang MT，Lo YW，Tsai CL，etal.Statin use and risk of COPD exacerbation requiring hospitalization〔J〕.Am J Med，2013；126(7)：598-606.

5 譚裕堯.高原地區(qū)慢阻肺急性加重期合并慢性肺心病抗氧化治療療效分析〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；15(3)：348-51.

6 Moy ML，Teylan M，Weston NA，etal.Daily step count is associated with plasma c-reactive protein and IL-6 in a US Cohort with COPD〔J〕.Chest，2014；145(3)：542-50.

7 Reed RM，Iacono A，De Filippis A，etal.Statin therapy is associated with decreased pulmonary vascular pressures in severe COPD〔J〕.COPD,2011；8(2)：96-102.

〔2016-12-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吉林省教育廳“十二五”規(guī)劃項目(No.20140126)

柳國洪(1969-)，男，副教授，主要從事內(nèi)科學研究。

R563

A

1005-9202(2017)09-2117-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.015