Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞生長、轉移和耐藥的影響

吳媛媛

(滄州市中心醫院腫瘤內科，河北 滄州 061000)

Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞生長、轉移和耐藥的影響

吳媛媛

(滄州市中心醫院腫瘤內科，河北 滄州 061000)

目的 探討Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞株H520生長、轉移和耐藥的影響。方法 使用慢病毒轉染體系建立穩定高表達Keap1的H520細胞株模型(H520-Keap1)，同時以Keap1失活的細胞株(H520-GFP)為陰性對照組；采用Western印跡法檢測各組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達，RT-PCR檢測Keap和Nrf2下游靶基因mRNA表達；通過SRB比色法、細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗、體外細胞藥敏實驗分別檢測各組細胞生長、轉移和耐藥情況。結果 H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量明顯高于H520-GFP細胞，Nrf2蛋白表達量明顯低于H520-GFP細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA表達量明顯高于H520-GFP細胞，H520-Keap1細胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相對表達量明顯高于H520-GFP細胞(P<0.01)。SRB比色法檢測顯示，第1～3天，H520-GFP與H520-Keap1細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05)；第4天起H520-Keap1細胞增殖率明顯低于H520-GFP(P<0.05)。H520-GFP細胞遷移率明顯高于H520-Keap1細胞(P<0.01)；H520-GFP細胞的侵襲數明顯高于H520-Keap1細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞對卡鉑、吉西他濱的敏感性增加。結論 Keap1過表達可影響人肺鱗癌H520細胞中Nrf2及其下游靶基因表達，抑制癌細胞生長和轉移，提升對卡鉑和吉西他濱的敏感性。

肺鱗癌；H520細胞；Keap1；Nrf2

肺鱗癌約占肺癌總數的80%，化療藥物耐受性是治療失敗的主要原因〔1〕。Keap1/Nrf2信號通路在細胞氧化應激中發揮關鍵作用〔2〕。研究發現，腫瘤發展過程中該信號通路發揮兩種不同作用，Nrf2可預防腫瘤產生，但在已形成的腫瘤組織中Nrf2異常表達會促進腫瘤生長〔3〕；Keap1是Nrf2的內源性酶抑制劑，可調控Nrf2的表達水平〔4〕。目前，Keap1/Nrf2信號通路對肺鱗癌細胞增殖、遷移、耐藥方面影響的研究鮮有報道，本研究旨在探討Keap1/Nrf2信號通路對肺鱗癌細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺鱗癌細胞株H520購于上海桑戈生物科技有限公司；真核重組質粒pGFP、pm Keap1-GFP購于上海舜百生物科技有限公司；DMEM細胞培養基、胎牛血清購于美國Amresco公司；一抗Keap1、Nrf2、β-actin購于上海鈺博生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于北京博然一新科技有限公司；SYBR Green試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司；卡鉑、吉西他濱購于齊魯制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 取對數期人肺鱗癌細胞H520，分為：①未轉染組；②陰性對照組：轉染慢病毒載體質粒pGFP(Lv-GFP)；③研究組：轉染過表達Keap1慢病毒載體質粒(Lv-Keap1)。取對數生長期H520細胞，接種于6孔板中，每孔根據病毒感染效率加入病毒液。加5 μg/ml溴化乙二甲銨，5 h后加血清，36 h后更換培養基，繼續培養60 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.2 Western印跡檢測 收集3組細胞，蛋白裂解后行蛋白定量，取50 μg蛋白，滴加上樣緩沖液，沸水浴加熱使蛋白變性后，電泳、轉膜、BSA封閉，滴加1∶1 000稀釋的Keap1、Nrf2、β-actin單克隆抗體，孵育過夜，加HRP標記的二抗，曝光后檢測3組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達情況。

1.2.3 RT-PCR檢測 提取3組細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，-20℃保存；Keap1和Nrf2下游靶基因(Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm)引物序列由北京賽百盛基因技術有限公司合成；RT-PCR總反應體系30 μl(上、下游引物各1 μl，cDNA 0.5 μl，Taq酶15 μl，雙蒸水12.5 μl)；反應條件：95℃變性20 min，93℃ 40 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個循環。

1.2.4 SRB比色法檢測3組細胞的增殖情況 取對數生長期3組細胞，按每孔2 000個細胞接種到96孔板中，每孔加入含胎牛血清的DMEM培養液150 μl，孵育24 h，10%三氯乙酸固定90 min，蒸餾水沖洗；每孔加入5 mg/ml的SRB溶液50 μl，室溫下靜置30 min，1%冰醋酸沖洗；每孔加入5 mmol/L的Tris，振蕩至晶體完全溶解，讀取510 nm波長處的吸光度值，設置3個復孔。

1.2.5 體外細胞遷徙和侵襲實驗 取對數期H520-GFP、H520-Keap1細胞，按1×106/孔的密度接種到6孔板中，培養24 h后在細胞表面用無菌注射器針頭制造劃痕，洗去漂浮細胞，加入不含血清的DMEM培養基拍照，培養24 h后拍照，比較細胞遷移率。將H520-GFP、H520-Keap1細胞以相同密度接種Transwell小室，含血清的DMEM培養基150 μl，下室加入500 μl無血清培養基，孵育24 h，結晶紫染色40 min，除去上室細胞，磷酸緩沖液沖洗，光學顯微鏡下隨機選取3個視野行細胞計數并拍照。

1.2.6 體外細胞藥敏檢測 取對數期H520-GFP、H520-Keap1細胞，2 000 r/min離心10 min，棄去上清，DMEM培養基重懸細胞，計數后按5 000個/孔密度接種到96孔板中，每孔滴加150 μl細胞培養液，孵育24 h，加入不同濃度的吉西他濱、卡鉑，設置3個復孔，繼續培養48 h，SRB比色法檢測細胞存活率，計算藥物對細胞增殖的IC50。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 質粒轉染人肺鱗癌細胞H520細胞情況 H520-GFP、H520-Keap1細胞轉染效率均>90%，見圖1。因Keap1蛋白主要在細胞質中表達，因此H520-Keap1細胞僅細胞質中存在綠色熒光。

圖1 H520-GFP和H520-Keap1細胞轉染效率(×200)

2.2 H520-Keap1細胞中Keap和Nrf2蛋白表達 H520-GFP、H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量分別為(4.31±1.82)、(9.24±1.06)；Nrf2蛋白表達量分別為(7.35±1.51)、(3.82±0.94)。H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量明顯高于H520-GFP細胞，Nrf2蛋白表達量明顯低于H520-GFP細胞(P<0.01)，見圖2。

圖2 3組細胞中Keapl和Nrf2蛋白表達情況

2.3 H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA和Nrf2下游靶基因表達 H520-GFP、H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA相對表達量分別為(1.17±0.31)、(7.69±1.44)，H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA表達量明顯高于H520-GFP細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相對表達量分別為(1.95±0.20)、(2.07±0.64)、(1.32±0.08)、(1.62±0.46)，明顯高于H520-GFP細胞中的(3.95±0.73)、(5.67±0.41)、(3.61±0.39)、(4.38±0.66)(P<0.01)。

2.4 過表達Keap1對H520細胞增殖的影響 第1～3天，H520-GFP與H520-Keap1細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05)；第4天起H520-Keap1細胞增殖率明顯低于H520-GFP(P<0.05)，見表1。

2.5 過表達Keap1對H520細胞遷移和侵襲力的影響 劃痕實驗顯示，24 h時H520-GFP細胞遷移率為(53.61±9.37)%，明顯高于H520-Keap1細胞的(36.28±6.32)%(P<0.01)。Transwell侵襲實驗顯示，H520-GFP細胞的侵襲數(291.53±21.27)個/高倍鏡視野，明顯高于H520-Keap1細胞的(148.20±12.16)個/高倍鏡視野(P<0.01)，見圖3。

與H520-GFP細胞比較：1)P<0.05

圖3 H520-GFP和H520-Keap1細胞侵襲能力(×100)

2.6 過表達Keap1對H520細胞化療藥物敏感性的影響 卡鉑、吉西他濱分別作用48 h后空白對照組H520細胞生長良好，卡鉑給藥組和吉西他濱給藥組均呈現劑量依賴的增殖抑制作用。其中卡鉑對H520細胞、H520-GFP細胞、H520-Keap1細胞的IC50分別為(87.51±5.63)μmol/L、(106.70±11.87)μmol/L、(51.06±4.64)μmol/L；吉西他濱IC50分別為(9.43±0.51)μmol/L、(9.86±0.48)μmol/L、(6.72±1.16)μmol/L，提示過表達Keap1的H520細胞株對卡鉑、吉西他濱的敏感性增加。

3 討 論

細胞抗氧化反應過程中Nrf2發揮中樞調節作用，是細胞正常狀態下抵抗外界不良刺激所產生的保護性應激反應的重要調控因子〔5〕。Keap1是Nrf2的內源性酶抑制劑，細胞質中Keap1與Nrf2結合后可介導其降解；但細胞處于氧化應激狀態

時，親核試劑和應激源作用于Keap1，誘發其構象改變，Keap1與Nrf2相互解離后失去介導Nrf2降解的活性，引發胞內Nrf2高表達〔6〕。中國目前對晚期肺鱗癌的治療仍首選化療，但耐藥性的產生常導致治療低于預期。相關研究顯示，癌細胞中因Keap1突變導致細胞核中Nrf2大量積累，Nrf2表達水平上升，會增加二相解毒酶、抗氧化酶基因、藥物泵基因等Nrf2調控的下游基因表達水平，加速抗腫瘤藥物在胞內的代謝速度，產生腫瘤細胞耐藥性〔7〕。研究發現，人卵巢癌細胞株對順鉑、奧沙利鉑的耐藥性與Nrf2表達水平呈明顯正相關〔8〕。本研究結果顯示，過表達Keap1可明顯提升H520細胞對卡鉑、吉西他濱的敏感性，可為提升肺鱗癌化療效果提供新的途徑。

1 周風舉，姜麗真，盧海燕，等.老年肺癌患者化療期間并發感染的高危因素〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(19)：5540-1.

2 王大朋.Keap1-Nrf2/ARE信號通路在砷致HaCaT細胞惡性轉化過程中的動態變化及其機制研究〔D〕.蘇州：蘇州大學，2015.

3 Koenigkam Santos M，Muley T，Warth A，etal.Morphological computed tomography features of surgically resectable pulmonary squamous cell carcinomas：impact on prognosis and comparison with adenocarcinomas〔J〕.Eur J Radiol，2014；83(7)：1275-81.

4 張逸平，李正祎.IL-24聯合大蒜素體外抗肺癌細胞生長的實驗研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(3)：335-8.

5 Zhu YJ，Xu B，Xia W，etal.Hsa-mir-182 downregulates RASA1 and suppresses lung squamous cell carcinoma cell proliferation〔J〕.Clin Lab，2014；60(1)：155-9.

6 楊勵勵.2010-2013年錦州市居民惡性腫瘤死亡原因分析〔J〕.中國衛生工程學，2016；15(1)：75-6.

7 Fode MM，Hilberg O，Bendstrup E，etal.Squamous cell carcinoma of the lung in lung transplantation--A relation to human papilloma virus〔J〕?Acta Oncologica，2012；51(6)：812-3.

8 Kim MJ，Shin HC，Shin KC，etal.Best immunohistochemical panel in disting adenocarcinoma from squamous cell carcinoma of lung：tissue microarray assay in resected lung cancer specimens〔J〕.Ann Diagnost Pathol，2013；17(1)：85-90.

〔2016-12-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

滄州市科技技術局項目(162302040)

吳媛媛(1978-)，女，碩士，主治醫師，主要從事腫瘤相關疾病的臨床診治研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2123-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.018