人參皂苷誘導黑色素瘤細胞B16-BL6凋亡的機制

李 祥 徐海霞 沈洪雷 詹 莉

(石嘴山市第一人民醫院中醫康復科，寧夏 石嘴山 753200)

人參皂苷誘導黑色素瘤細胞B16-BL6凋亡的機制

李 祥 徐海霞1沈洪雷 詹 莉

(石嘴山市第一人民醫院中醫康復科，寧夏 石嘴山 753200)

目的 探討人參皂苷誘導黑色素瘤細胞B16-BL6凋亡的機制。方法 培養黑色素瘤細胞B16-BL6，5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 0、12、24、48、72 h，膽囊收縮素(CCK)8試驗檢測人參皂苷對細胞增殖的影響；10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，流式細胞儀檢測人參皂苷對細胞凋亡的影響；Western印跡檢測與凋亡相關蛋白的表達。結果 隨著時間的延長和濃度的增加，人參皂苷對細胞的抑制率增加，表現出時間和濃度的依賴性。72 h后，人參皂苷對細胞的抑制率到了平臺期，用5 μg/ml的人參皂苷處理黑色素瘤B16-BL6細胞，細胞的抑制率較低，因此后期選擇10、20、40 μg/ml的人參皂苷為研究對象，用10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，各濃度組早期凋亡和晚期凋亡的細胞顯著高于對照組，且呈劑量依賴性(P<0.01)。隨著人參皂苷濃度的增加，Bax蛋白表達量增加，而Bcl-2蛋白表達量減少，兩者之間的比例增加，而且呈劑量依賴性。隨著人參皂苷濃度的增加，細胞色素(Cyt)C和細胞凋亡誘導因子(AIF)含量增加，且呈劑量依賴性。結論 人參皂苷抑制黑色素瘤細胞B16-BL6增殖，促進細胞凋亡，其凋亡機制可能與Bcl-2家族Bcl-2和Bax兩者之間的比例改變、線粒體膜通透性改變、促使一些凋亡因子的釋放有關。

人參皂苷；黑色素瘤細胞；凋亡；線粒體

黑色素瘤具有高的轉移力和侵襲力〔1〕，雖然通過手術、化療等途徑能起到緩解的效果，但黑色素瘤一旦發生轉移，幾乎沒有藥物可以治愈〔2〕。隨著對人參以及同屬植物在抗腫瘤方面活性的研究，人參皂苷在抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等方面所發揮的作用被發現〔3〕。研究顯示，人參皂苷能抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，誘導小鼠黑色素瘤細胞的凋亡〔4〕。本研究擬探討人參皂苷誘導黑色素瘤細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 黑色素瘤細胞B16-BL6購于中國科學院細胞庫。主要試劑和儀器：RPMI1640細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Invitrogen Gibco；胰蛋白酶購自美國Sigma；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司；青鏈霉素購自華北制藥廠；鼠抗人B淋巴細胞-2(Bcl-2)多克隆抗體購自美國Newmac；兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人細胞色素C(Cyt C)多克隆抗體、兔抗人細胞凋亡誘導因子(AIF)多克隆抗體購自美國CST；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；細胞培養箱購自美國西盟公司；酶標儀購自Thermo Labsystems公司；流式細胞儀購自美國BD。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將黑色素瘤細胞B16-BL6從液氮罐中取出，放入37℃的水浴鍋中溶解，溶解過程中輕搖凍存管，使之在1 min內溶解。凍存管中加入含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養基中，1 000～1 200 r/min離心5 min，吸掉上清，細胞生長液懸浮細胞，細胞接種于96孔培養板中，37℃、5% CO2培養箱中培養48 h，更換培養基。細胞融合度達到90%后，用0.25%胰酶消化貼壁細胞，1 000 r/min離心5～8 min，除去酶消化液，PBS重懸細胞，離心后加入細胞生長液，將細胞種植于培養板中，37℃、5%CO2濃度培養箱中培養。

1.2.2 膽囊收縮素8(CCK8)檢測細胞增殖 取對數生長期的黑色素瘤細胞B16-BL6，0.25%的胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心5 min，調整細胞濃度為5×104個/孔，細胞接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液200 μl，培養箱中培養24 h。加入終濃度為5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 0、12、24、48、72 h后，加入10 μl CCK8溶液，37℃，5% CO2培養箱孵育2 h，酶標儀在波長為450 nm處測定并記錄各組吸光度OD值。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取生長至對數期的黑色素瘤細胞B16-BL6，胰酶消化，37℃飽和濕度、5% CO2條件下培養48 h后，調整細胞濃度為2×106個/ml，取1 ml細胞懸液至離心管中，4℃，1 000 r/min離心8～10 min。棄上清，加入1 ml冰預冷的PBS 重懸細胞，1 000 r/min，離心8～10 min，棄上清，PBS重復洗滌細胞2次，加入Binding Buffer 200 μl重懸細胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI，避光室溫靜置20 min，加300 μl PBS，用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.2.4 Western印跡檢測蛋白表達 各個時間點的黑色素瘤細胞B16-BL6培養48 h，1 200 r/min離心收集細胞，裂解液冰上裂解細胞，14 000 r/min離心，收集上清。按照試劑盒說明提取細胞蛋白并測定提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃變性5 min。每孔加入50 μl樣品，電泳。電泳結束后，取出蛋白凝膠，將濾紙、凝膠、聚偏氟丙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉膜過夜。取膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗二抗孵育。TBST洗膜3次，顯影，通過Odyssey掃描系統分析蛋白表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 CCK8檢測人參皂苷對細胞增殖的影響 5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，隨著時間的延長和濃度的增加，人參皂苷對細胞的抑制率增加，表現出時間和濃度的依賴性。72 h后，人參皂苷對細胞的抑制率達到平臺期，用5 μg/ml的人參皂苷處理黑色素瘤B16-BL6細胞，細胞的抑制率較低，因此后期選擇10、20、40 μg/ml的人參皂苷為研究對象。見圖1。

與0 h比較：1)P<0.01 圖1 人參皂苷對細胞黑色素瘤細胞增殖的影響

2.2 人參皂苷對細胞凋亡的影響 10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，各濃度組早期凋亡和晚期凋亡的細胞顯著高于對照組(0 μg/ml)，且呈劑量依賴性(P<0.01)，且以晚期凋亡為主。見表1。

表1 人參皂苷對黑色素瘤細胞B16-BL6凋亡的影響±s,%)

與0 μg/ml組比較：1)P<0.01；下表同

圖2 Western印跡檢測不同濃度的人參皂苷對B16-BL6 細胞Bcl-2和Bax 蛋白表達的影響

2.3 人參皂苷對黑色素瘤細胞B16-BL6中Bcl-2 家族蛋白的影響 見圖2，表2。10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，Western印跡檢測結果顯示，隨著人參皂苷濃度的增加，Bax蛋白表達量增加，Bcl-2蛋白表達量減少，兩者之間的比例增加，而且呈劑量依賴性。

表2 不同濃度的人參皂苷作用后黑色素瘤細胞B16-BL6中Bcl-2和Bax蛋白的表達

2.4 人參皂苷對一些凋亡因子的影響 當線粒體膜的通透性改變時，就會導致Cyt C、AIF等凋亡因子的釋放，從而啟動凋亡程序。Western印跡檢測結果顯示，隨著人參皂苷濃度增加，AIF和Cyt C蛋白表達量增加，表現出劑量依賴性。見圖3，表3。

圖3 Western印跡檢測不同濃度的人參皂苷作用后 B16-BL6細胞中Cyt C、AIF蛋白的表達

組別CytCAIF0μg/ml組0157±00090053±000410μg/ml組0243±00101)0108±00051)20μg/ml組0359±00111)0197±00081)40μg/ml組0468±00131)0268±00091)

3 討 論

研究顯示，人參皂苷對腫瘤增殖凋亡及免疫等方面發揮重要作用，這為從分子生物學和細胞生物學角度研究抗腫瘤提供了一個新的視野〔5〕。雖然人參皂苷具有很廣的抗腫瘤活性，但對于不同的腫瘤細胞人參皂苷的抗腫瘤機制是不同的〔6〕。

本研究結果顯示，人參皂苷對黑色素瘤細胞的增殖具有抑制作用，其抑制率具有時間和劑量依賴性。

Annexin V能與在細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸結合，使其染色，而PI不能通過完整的細胞膜，因此發生凋亡的細胞的細胞膜不能染色，但PI可以通過中晚期細胞和壞死細胞的細胞膜，可以染色。兩種方法合用，可以將早、中、晚細胞和壞死細胞以及正常細胞區分出來〔7〕。

Bcl-2存在于線粒體上，對線粒體膜具有調節功能，線粒體膜通透性轉換孔(PT)與Bcl-2和Bax之間存在緊密的聯系，Bcl-2家族蛋白與PT孔的組成之間存在一定的關系，而細胞凋亡是由PT孔開放直接導致的〔8～10〕。本研究結果說明人參皂苷引起黑色素瘤細胞B16-BL624凋亡，可能是通過使Bcl-2和Bax兩者之間的比例改變、對線粒體膜通透性造成影響實現的。

細胞凋亡過程中，線粒體膜電位下降、通透性改變，導致Cyt C、AIF等凋亡因子釋放到細胞質中，從而啟動凋亡程序〔11〕。10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細胞B16-BL6 48 h后，隨著人參皂苷濃度的增加，Cyt C和AIF蛋白的含量增加，且呈劑量依賴性，說明在凋亡過程中Cyt C、AIF存在由線粒體向細胞質的釋放。這也提示線粒體在人參皂苷誘導黑色素瘤細胞B16-BL6凋亡過程中發揮重要作用。

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11 李 成,梁慶威,周志成,等.Bim 在激素誘導成骨細胞凋亡中的表達及意義〔J〕.中國醫科大學學報,2015;44(10):921-5.

〔2016-10-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

李 祥(1969-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事中醫康復方面研究。

R285

A

1005-9202(2017)09-2126-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.019

1 石嘴山市第一人民醫院藥房