miR-517a-3p對人肺鱗癌細胞生長和轉移的影響及分子機制

時昌立 秦德華 丁廣成 李朋朋 田 碧

(鄭州大學第五附屬醫院腫瘤治療中心，河南 鄭州 450052)

miR-517a-3p對人肺鱗癌細胞生長和轉移的影響及分子機制

時昌立 秦德華 丁廣成 李朋朋 田 碧

(鄭州大學第五附屬醫院腫瘤治療中心，河南 鄭州 450052)

目的 探討miR-517a-3p對人肺鱗癌細胞生長和轉移的影響及分子機制。方法 肺鱗癌細胞株H460培養24 h后用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染，分為miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組，并設空白對照組。CCK8檢測3組細胞的增殖情況；Transwell檢測細胞的侵襲能力；Western印跡檢測細胞中侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達水平。構建e2f6-3′Utr區的雙熒光素酶報告載體，檢測miR-517a-3p對下游靶基因e2f6的調控作用。結果 CCK8檢測顯示，miR-517a-3p過表達組細胞增殖速度較空白對照組明顯降低，miR-517a-3p 表達抑制組增殖率明顯提升(P<0.05)。miR-517a-3p 過表達組H460穿膜數明顯低于空白對照組；miR-517a-3p 表達抑制組穿膜數明顯高于空白對照組(P<0.05)。miR-517a-3p 過表達組MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量均明顯低于空白對照組，miR-517a-3p 表達抑制組明顯高于空白對照組(P<0.05)。過表達miR-517a-3p可明顯下調e2f6-3′Utr的報告載體熒光素酶活性，抑制miR-517a-3p表達后可上調熒光素酶活性，與空白對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。過表達miR-517a-3p后e2f6的表達量明顯低于空白對照組；抑制miR-517a-3p表達后，e2f6的表達量明顯高于空白對照組(P<0.05)。結論 miR-517a-3p可通過調控下游靶基因e2f6而抑制肺鱗癌細胞株H460的生長和侵襲力。

miR-517a-3p；肺鱗癌

肺鱗癌約占肺癌總數的40%，且多為老年患者，發病率近10年呈快速增長趨勢〔1〕。miRNA在真核生物細胞活動及多種腫瘤發展中具有調控作用〔2〕。相關研究顯示，miR-517a-3p可通過靶向作用于Wee1基因抑制腎癌細胞遷徙和侵襲力〔3〕，提示具有抑癌基因的作用。目前，miR-517a-3p對人肺鱗癌細胞的作用鮮有報道。本研究旨在探討miR-517a-3p對人肺鱗癌細胞株H460生長和轉移的影響及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H460購于南京森貝伽生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、optimem培養基購于上海索萊寶生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體、miR-517a-3p minics、miR-517a-3p inhibitor購于廣州市銳博生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒、PCR擴增引物購于上海信裕生物技術有限公司；Transwell培養板、膽囊收縮素8(CCK8)試劑、雙熒光素酶檢測試劑盒購于威格拉斯生物技術(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 H460放入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，放入CO2孵箱中培養過夜。取對數期細胞，按1×106個/孔接種到6孔板中，培養24 h后用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染，分為miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組，并設空白對照組。

1.2.2 實時定量RT-PCR和CCK8檢測 轉染48 h后Trizol法提取H460細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，行RT-PCR反應，反應體系30 μl，反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；60℃ 30 s，共進行40個循環。CCK8檢測：將轉染48 h的細胞培養基棄去，按1∶1比例每孔加入200 μl的DMEM培養基，37℃ CO2培養箱中孵育2 h，讀取495 nm處的吸光度值。

1.2.3 Transwell檢測細胞侵襲力 將鋪有基質膠的Transwell培養板37℃預熱，消化細胞用無血清的DMEM培養基沖洗，細胞密度調整為1×106個/孔，接種到上室，300 μl/孔；下室中加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養液，孵育24 h，取出Transwell培養板，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，4%甲醛溶液固定20 min，結晶紫染色后顯微鏡下觀察、計數。

1.2.4 Western印跡檢測 取對數期H460細胞，1×106個/孔密度接種到培養皿中，分別轉染miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組，48 h后裂解細胞提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，濕法轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉3 h，滴加一抗，4℃環境下孵育過夜，PBS洗滌后滴加二抗，室溫下孵育3 h，化學發光法顯示，凝膠系統采集圖像。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測 構建MriGlo/e2f6-3′Utr和PmirGlo/e2f6-3′Utr mut報告載體，使用基因轉染試劑分別與miR-517a-3p 過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組、空白對照組共轉染到H460細胞中，培養48 h后裂解細胞，檢測熒光素酶活性，分別記為實驗組(A1)、熒光素酶表達載體(A2)，計算A1/A2為相對熒光素酶活性。

1.3 統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 miR-517a-3p對肺癌細胞株H460增殖能力的影響 miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p表達抑制組中miR-517a-3p表達量分別為(13.61±2.35)、(2.39±0.52)，與空白對照組(7.19±1.07)比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示轉染成功。CCK8法檢測細胞增殖情況顯示，miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組、空白對照組吸光度值分別為(47.36±8.02)、(162.39±25.61)、(105.18±11.89)，miR-517a-3p過表達組細胞增殖速度較空白對照組明顯降低，miR-517a-3p 表達抑制組增殖率明顯提升(P<0.05)。

2.2 miR-517a-3p對H460侵襲力的影響 miR-517a-3p 過表達組H460穿膜數為(46.68±7.35)，明顯低于空白對照組的(118.50±13.28)；miR-517a-3p 表達抑制組為(143.92±15.30)，明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 Transwell檢測miR-517a-3p對H460 侵襲力的影響(×200)

2.3 miR-517a-3p對H460侵襲相關蛋白表達的影響 miR-517a-3p過表達組、miR-517a-3p表達抑制組、空白對照組MMP-2蛋白相對表達量分別為(4.369±0.525)、(10.284±1.136)、(7.390±0.954)；MMP-9蛋白相對表達量分別為(2.920±0.374)、(7.367±0.952)、(5.312±0.628)。miR-517a-3p 過表達組MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量均明顯低于空白對照組，miR-517a-3p 表達抑制組明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-517a-3p對H460細胞MMP-2和 MMP-9蛋白表達影響

2.4 miR-517a-3p對e2f6靶序列的作用 miR-517a-3p 過表達組、miR-517a-3p 表達抑制組、空白對照組野生型e2f6-3′Utr的報告載體熒光素酶活性分別為(0.541±0.036)、(1.695±0.428)、(1.059±0.495)。過表達miR-517a-3p可明顯下調e2f6-3′Utr的報告載體熒光素酶活性，抑制miR-517a-3p表達后可上調熒光素酶活性，與空白對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.5 miR-517a-3p調控H460細胞中e2f6的表達情況 空白對照組H460細胞中e2f6的表達量為(4.914±0.751)，過表達miR-517a-3p后e2f6的表達量為(1.957±0.136)，明顯低于空白對照組；抑制miR-517a-3p表達后，e2f6的表達量為(7.602±0.665)，明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-517a-3p調控H460細胞中e2f6的表達

3 討 論

miRNA與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關，且多定位在基因組中癌癥相關的位點，近年來多項相關研究證實miRNA異常表達與肺鱗狀上皮細胞癌有明顯關聯，如miR138可通過影響PDK信號通路來抑制肺鱗癌細胞的增殖、分化〔4〕；miR143、miR21的表達水平與肺鱗狀上皮細胞癌患者病理特征和治療預后明顯相關〔5〕。相關研究發現，miR-517a-3p在多種惡性腫瘤組織中存在異常表達，且發揮不同作用，如miR-517a-3p可通過降低細胞周期檢測點激酶(CHK)1表達水平可抑制宮頸癌的發生、發展，有效預測宮頸癌的治療預后〔6〕；miR-517a-3p還與前列腺癌、胰腺癌等多種癌細胞侵襲有關〔7〕。

本研究說明肺鱗癌組織中miR-517a-3p發揮抑癌基因的作用；同時細胞侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9的相對表達量均明顯降低，進一步說明過表達miR-517a-3p可有效抑制人肺鱗癌細胞的侵襲力。相關研究顯示，e2f6可有效抑制DNA功能缺損導致的細胞凋亡，其在宮頸鱗癌組織中表達下調，可能與宮頸癌發生和進展有關〔8〕。本次研究顯示，miR-517a-3p的表達與e2f6呈負相關，進一步對e2f6蛋白表達檢測顯示，miR-517a-3p負向調控人肺鱗癌細胞中的e2f6蛋白表達，其具體功能和機制仍需進一步深入研究。

1 田 文，高敬華，李永生，等.紫杉醇脂質體單藥與紫杉醇脂質體聯合順鉑治療老年中晚期肺鱗癌的療效比較〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(8)：2076-7.

2 吳建軍.NNK誘導肺癌發生過程中循環microRNA標志物研究〔D〕.廣州：南方醫科大學，2013.

3 李欲哲，高艷麗，孫 崴.香坊區2014年惡性腫瘤發病與死亡分析報告〔J〕.中國衛生工程學，2016；15(3)：298-300.

4 陳 旭，王 琳，蔣 敏，等.肺癌患者血清和單個核細胞9種miRNAs表達差異及其意義〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2013；36(2)：165-72.

5 唐夏莉，焦德敏，陳 君，等.miRNA-126對肺癌 A549細胞的增殖、遷移、侵襲及 EGFR/AKT/mTOR 信號通路的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2016；32(3)：458-63.

6 顧澤鑫，趙微微.肺鱗癌術后組織中轉移相關蛋白2、上皮型黏附素和組織蛋白酶K表達及意義〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(18)：5194-5.

7 李海洋，趙振山.肺癌患者放療前后外周血淋巴細胞亞群變化研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(2):213-6.

8 盧韶華.肺癌患者組織及血漿miRNA腫瘤標記物的發現及驗證〔D〕.上海：復旦大學，2010.

〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

時昌立(1985-)，男，在讀碩士，醫師，主要從事腫瘤治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.021