UPLCPDA同時測定藏藥翼首草環烯醚萜苷和酚酸類10個化學成分的含量

唐策 文檢 王靜++趙可惠　范剛 孟憲麗　鄒忠梅　張藝

[摘要] 建立超高效液相色譜法（UPLCPDA）同時測定藏藥翼首草環烯醚萜和酚酸類10個化學成分的含量。采用Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相0.2%磷酸水（A）乙腈（B），梯度洗脫，檢測波長237，325 nm，流速0.4 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。研究結果表明UPLCPDA法定量分析翼首草10個化學成分在考察的范圍內線性關系良好（r≥0.999 7）；加樣回收率為96.30%～103.0%（n=9），RSD為0.72%～2.9%（n=9）。所建立UPLC方法簡便、準確、重復性好，可同時測定藏藥翼首草中10個化學成分的含量。

[關鍵詞] 藏藥； 翼首草； UPLCPDA； 環烯醚萜； 酚酸； 含量測定

Simultaneous determination of ten major compounds including iridoid

glycosides and phenolic acids in Pterocephalus hookeri by UPLCPDA

TANG Ce1， WEN Jian1， WANG Jing1， ZHAO Kehui1， FAN Gang1， MENG Xianli1， ZOU Zhongmei2， ZHANG Yi1*

（1.College of Ethnic Medicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2.Institute of Mechcinal Plant Development， Chinese Acadeuy of Medical Scieuce and Peking Union Medical

College， Beijing 100193， China）

[Abstract] This study is to develop an UPLCPDA method for determination of 10 major components in Pterocephalus. The UPLCPDA assay was performed on a Waters Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）， and the column temperature was at 30 ℃. The mobile phase consists of water containing 0.2% phosphoric acid （A） and acetonitrile （B） in gradient elution at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The detection wave length was set at 237 and 325 nm， and the injection volume was 1 μL in the UPLC system. The linear range of 10 detected compounds were good （r≥0.999 7）， and the overall recoveries ranged from 96.30% to 103.0%， with the RSD ranging from 0.72% to 2.9%. The method was simple， accurate and reproducible， which can be used for the simultaneous determination of the content of ten major components in P. hookeri.

[Key words] Tibetan medicine； Pterocephalus hookeri； UPLCPDA； iridoid glycoside； phenolic acid； content determination

翼首草（藏語名：榜孜毒烏）為川續斷科匙葉翼首草Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）Heck 的干燥全草，收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]及衛生部《藏藥部頒標準》[2]中，為常用藏藥。翼首草主要含有環烯醚萜類和皂苷類成分，如馬錢苷、吳茱萸苷、齊墩果酸和熊果酸等[39]，具有抗病毒、抗氧化及提高免疫力等作用。課題組前期對翼首草進行了LCQTOFMS的化學成分分析，首次發現翼首草中含有大量的馬錢苷酸、異綠原酸A、異綠原酸C、林生續斷苷Ⅰ、續斷苷B和續斷苷A，且這些化學成分具有較強的紫外吸收。因此，本文采用UPLCPDA對其環烯醚萜和酚酸類10個化學成分進行含量測定，為翼首草的質量控制提供新的科學依據。

1 材料

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀，包括四元溶劑管理系統、樣品管理系統、PDA檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BT125D 1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；KQ500E超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

馬錢苷酸（111865201102）、綠原酸（110753201413）和馬錢苷（111640201509）購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A（16031611）、異綠原酸C（16031613）購自成都曼思特生物科技有限公司；獐牙菜苷、林生續斷苷Ⅰ、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A由本實驗室分離制備；經光譜及高效液相色譜分析確認，純度均在98%以上。HPLC級甲醇、乙腈（美國J.T.Baker公司），水為屈臣氏蒸餾水（可供UPLC/UPLCMS測定）；HPLC級甲酸（美國Tedia公司）。甲醇、磷酸試劑均為分析純。

翼首草藥材16批見表1，自采于四川、云南，經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定為川續斷科匙葉翼首草P. hookeri的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相0.2%磷酸水（A）乙腈（B），梯度洗脫（0～4 min，10%～12%B；4～5 min，12%～17%B；5～10 min，17% B；10～14 min，17%～25% B；14～15 min，25% B），檢測波長237，325 nm，流速0.4 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取翼首草粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷、馬錢苷、異綠原酸A、林生續斷苷Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A對照品適量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含馬錢苷酸0.159 mg、綠原酸0.305 mg、獐牙菜苷0.175 mg、馬錢苷1.101 mg、異綠原酸A 0.253 mg、林生續斷苷 Ⅰ0.385 mg、異綠原酸C 0.138 mg、吳茱萸苷1.385 mg、續斷苷B 0.065 mg和續斷苷A 0.130 mg溶液。

2.3 線性關系考察

精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液，按不同比例加入70%甲醇溶液稀釋，制成一系列濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定。以對照品濃度（mg·L-1）（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程，見表2。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取2.2.2項下制備的混合對照品溶液1 μL，按2.1項下的色譜條件，重復進樣6次，測定10個化學成分的峰面積，結果計算馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、異綠原酸A、林生續斷苷 Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A的RSD分別為0.43%～0.91%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一批次（S16）供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h，按2.1項下的色譜條件測定，結果計算得馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、異綠原酸A、林生續斷苷 Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A的RSD均在0.59%～3.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批次（S16）的翼首草藥材粉末6份，按2.2.1項下制備翼首草供試品溶液，按照上述條件分別進樣，測定翼首草供試品溶液10個化學成分的峰面積，計算得馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、異綠原酸A、林生續斷苷Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A的RSD均在1.4%～4.3%，表明重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 取已知含量的翼首草藥材粉末9份，每份約0.25 g，分別加入適量的混合對照品溶液，按2.2.1項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，計算馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、異綠原酸A、林生續斷苷Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A的回收率在96.30%～103.0%，RSD在0.72%～2.9%，見表3。

2.5 樣品含量測定

分別取不同批次的翼首草藥材，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、異綠原酸A、林生續斷苷Ⅰ、異綠原酸C、吳茱萸苷、續斷苷B和續斷苷A的含量。UPLC見圖1，含量測定結果見表4。

3 討論

本文考察了Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Acquity UPLCR HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱對10個化學成分離效果，結果Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱分離效果最佳。

本文建立了同時快速測定藏藥翼首草環烯醚萜和酚酸類10個化學成分含量的方法，出峰時間減少為15 min，10個化學成分中馬錢苷酸、異綠原酸A、異綠原酸C、續斷苷A和續斷苷B為首次從翼首草藥材中測到。通過UPLCPDA發現，酚酸類成分：綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C在325 nm具有最大吸收，其他7個環烯醚萜類成分在237 nm處有最大吸收，故本實驗在237，325 nm處分別作為檢測波長。

量測定，發現每批翼首草中含量相對最高的均是吳茱萸苷，其中四川省阿壩縣麥昆鄉草原社的翼首草中吳茱萸苷最高，為63.97 mg·g-1，各產地樣品中續斷苷A含量均高于續斷苷B，其他化合物的含量也不盡相同。

2015年版《中國藥典》（一部）中以齊墩果酸和熊果酸的含量為指標，規定翼首草藥材中含齊墩果酸和熊果酸的總量不得少于0.20%。從表4可發現，翼首草中含有的環烯醚萜和酚酸類成分遠遠高于0.20%，而且齊墩果酸和熊果酸在大量的植物中含有，其專屬性差。因此，2015年版《中國藥典》（一部）中翼首草的質控標準是否恰當，值得深入研究。

[參考文獻]

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[責任編輯 丁廣治]