石柱黃連根腐病根際土壤細菌微生態研究

宋旭紅　王鈺　李隆云　譚均

[摘要] 該研究應用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺，分析了未種植黃連土壤、黃連健株及病株根際土壤的細菌種群豐富度及多樣性變化，并結合土壤養分及酶活變化檢測，對黃連根腐病產生的機制進行了深入探討。高通量測序顯示，栽培黃連造成了土壤細菌種群的豐富度的顯著降低（P<0.05）和細菌種群多樣性的降低；罹患根腐病的黃連植株根際土壤細菌的種群豐富度要顯著低于未種植和健康黃連土（P<0.05），種群多樣性要顯著低于未種植黃連土樣（P<0.05），但與健株土樣之間差異不顯著。對土壤的養分及酶活測定結果表明，栽培黃連造成了土壤pH、有效磷、脲酶活性的顯著降低，蔗糖酶活性的顯著升高（P<0.05）；根腐病土樣中有機碳的含量、堿解氮、過氧化氫酶和脲酶活性顯著低于健康土樣，速效磷和速效鉀含量顯著高于健康土樣（P<0.05）。綜合分析表明，栽培黃連造成了土壤中細菌種群豐富度和多樣性的降低；病株土樣中，細菌種群豐富度的顯著降低和種群多樣性的降低，有可能是導致黃連根腐病產生的一個重要原因，此外，土壤有機碳和過氧化氫酶活性的顯著減低，也許是導致黃連根腐病發生的一個誘因。

[關鍵詞] 黃連； 根腐??； 土壤酶活性； 土壤養分； 高通量測序； 細菌

Research on bacteria microecology in root rot rhizosphere soil of Coptis chinensis produced in Shizhu city

SONG Xuhong1，2，3， WANG Yu1，2，3， LI Longyun1，2，3*， TAN Jun1，2，3

（1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065， China；

2. Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica，

Chongqing 400065， China；

3. Chongqing Subcenter of National Resource， Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese

Medical Science， Chongqing 400065， China）

[Abstract] Illumina Hiseq 2500 highthroughput sequencing platform was used to study the bacteria richness and diversity， the soil enzyme activities， nutrients in unplanted soil， rootrot and healthy rhizophere soil of Coptis chinensis for deeply discussing the mechanism of the rootrot of C. chinensis. The highthroughput sequencing result showed that the artificial cultivation effected the bacteria community richness and diversity. The bacteria community richness in healthy and diseased rhizosphere soil showed significant lower than that of in unplanted soil （P<0.05） and declined bacteria diversity. The bacteria community richness in rootrot rhizosphere soil increased significantly than that of health and unplanted soil and the diversity was lower significant than that of unplanted soil （P<0.05）. The results of soil nutrients and enzyme activities detected that the pH value， available phosphorus and urease activity decreased and the sucrase activity increased significantly （P<0.05）. The content of organic carbon and alkaline hydrolysis nitrogen the catalase and urease activity in root rot soil samples was significantly lower than that of healthy soil samples （P<0.05）. However， the contents of available phosphorus and available potassium were significantly in rootrot sample higher than that of healthy soil samples （P<0.05）. Comprehensive analysis showed that the artificial cultivation declined the bacteria community richness and diversity. The bacteria community richness decreased significantly and the decreased diversity may be the cause of the rootrot. Meanwhile， the decrease of carbon and the catalase activity may be another cause of the rootrot in C. chinensis produced in Shizhu city， Chongqing province.

[Key words] Coptis chinensis； rootrot； enzyme activities in soil； the nutrients of soil； illumina highthroughput sequencing； bacteria

黃連Coptis chinensis Franchet為毛茛科多年生草本植物，以根莖入藥，藥材名味連、雞瓜連，為2015年版《中國藥典》[1]一部收錄，是我國常用大宗中藥材。黃連主要分布于重慶市東部、湖北省西部、湖南省北部、陜西省南部、貴州省等地，現主產于重慶市石柱縣及湖北省利川市。石柱黃連的市場銷售量為我國黃連銷售量的60%以上。石柱黃水鎮周邊栽培黃連已有400多年的歷史。近年來，隨著黃連栽培面積的不斷擴大，土地重復栽連等導致石柱黃連病害尤其是黃連根腐病發生日益嚴重。

中藥材根腐病主要由真菌、細菌和線蟲等引起[2]，土壤微生物區系及生理代謝的變化也會引起中藥材土傳病害的發生[34]。對石柱黃連根腐病的調查發現，黃連根腐病常年發病率10%～20%，嚴重的地塊發病率在60%～90%，甚至絕收，黃連根腐病的發生直接影響黃連藥材的產量和質量，給連農造成較大的經濟損失。根腐病發生后，連農一般采取拔除病株等方法，很難根除根腐病病菌[5]。到目前為止，還沒有一種有效的防治黃連根腐病的方法。因此全面分析和比較未種植黃連土壤、健康黃連土壤和罹患病害黃連根際土壤的養分，酶活及土壤微生物種群多樣性變化對揭示黃連根腐病的發生規律和機制尤為必要。

本研究對未種植黃連的土壤、黃連健康植株和發生根腐病的植株的根際土壤進行了養分、酶活等分析，同時采用Illumina Hiseq2500 PE250高通量測序平臺，對以上3種土壤的細菌進行種群組成、豐富度及多樣性變異分析，以期深入了解黃連根腐病發生的機制，為綜合防治提供科學依據，以促進石柱黃連產業健康、可持續性發展。

1 材料和方法

1.1 實驗設計 取樣地點在重慶市石柱縣黃水鎮GAP種植基地（東經108°26′，北緯29°59′），海拔1 667 m，年降水量為1 200 mm，年平均氣溫為16 ℃。以三年生栽培黃連健康和發病植株根際、未種植黃連土壤為研究對象。在根腐病發生盛期內（2015年8月5日），利用抖根法獲得黃連根際土壤樣本，2種處理土樣均采用5點取樣，每個取樣點至少取10株，混合土壤，一部分用滅菌的鑷子挑揀出植物殘渣后轉入滅菌袋中，放入車載冰箱及時帶回，然后-80 ℃超低溫冰箱保存供提取DNA使用；一部分挑出植物殘渣后常溫下陰干，過篩后做土壤養分及酶活性測定使用。同時采集種植黃連地塊周圍未種植過黃連的土壤，小心清理干凈土層表面覆土，在深度為5～15 cm土層，五點取樣，混合樣本處理同根際土。黃連健株、病株根際土在文章中分別表示為H.RMS3 和D.RMS3；未種植黃連的土壤記為N.RMS3。

1.2 土壤養分及土壤酶活性檢測 土壤pH采用土水比例為1∶20；有機碳含量測定采用重鉻酸鉀容量法稀釋熱法測定，土壤堿解氮采用堿解擴散法，速效鉀采用NH4OAc浸提火焰光度法，速效磷分別采用鉬銻抗比色法測定法[6]。土壤脲酶、蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性檢測使用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒。

1.3 土壤總DNA提取 使用美國MP 生物公司（Fast DNATM SPIN Kit for Soil）土壤DNA提取試劑盒提取土壤總DNA，利用瓊脂糖電泳檢測DNA的純度和濃度，用滅菌后的超純水稀釋至1 mg·L-1。

1.4 土壤細菌擴增及測序等后續分析 16SV4區引物為F515（5′GTGCCAGCMGCCGCG3′）和R806 （5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶（400～450 bp）使用德國Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

使用TruSeq DNA PCRFree Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用北京諾禾致源生物信息科技有限公司的Hiseq2500 PE250平臺進行上機測序及分析。測序結束后，對各樣品數據進行去雜、拼接[7]、過濾[8]、去除嵌合體[9]等處理，得到最終有效數據（effective tags）。根據序列相似性（大于97%）形成操作分類單元（operational taxonomic units，OUTs），RDP Classifier方法（Version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdpclassifier/[10]與GreenGene數據庫（http：//greengenes.lbl.gov/cgibin/nphindex.cgi）進行物種注釋分析[11]，使用PyNAST軟件（Version 1.2）[12]與GreenGene數據庫中的“Core Set”數據信息進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。 最后對各樣品的數據進行均一化處理，以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。 使用Qiime（Version 1.7.0）計算Observedspecies，Shannon，Simpson，Chao 1，ACE指數及反映測序深度的Goodcoverage指數并計算Unifrac距離、構建UPGMA樣品聚類樹。使用R軟件（version 2.15.3）繪制稀釋曲線，Veen圖和物種豐富聚類熱圖和β多樣性指數熱圖。

1.5 數據統計分析 采用Excel 2003和SPSS 16.0（SPSS Inc.，USA）軟件對數據進行統計分析，采用最小顯著差數法（Oneway ANOVA，LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 未種植黃連、黃連健株和病株土樣養分變化 未種過黃連的土pH顯著高于病株和健株黃連根際土壤（P<0.05），健株黃連根際土壤有機碳含量顯著高于病株土樣和未種植黃連土樣（P<0.05），但是病株根際土和未種植黃連根際土有機碳含量差異不顯著；3種處理土樣堿解氮的變化為健株土樣最高，未種植土樣次高，病株土樣最低，三者之間差異顯著（P<0.05）。速效磷的含量變化為未種植土樣最高，病株土樣其次，健株土樣最低，三者之間差異顯著（P<0.05）。速效鉀的含量在病株土樣中最高，顯著高于健株和未種植黃連土樣（P<0.05），但是健株和未種植黃連土樣速效鉀含量差異不顯著，見表1。

2.2 未種植黃連、黃連健株和病株土樣酶活性的變化 3種處理土壤之間酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性之間差異不顯著；病株土樣多酚氧化酶活性高于與健株土樣和未種植黃連土樣該酶活性，但與健株土樣之間差異不顯著，但是，健株土樣和未種植黃連土樣之間差異不顯著。健株土樣中過氧化氫酶的活性顯著高于病株土樣和未種植黃連土樣（P<0.05），其中，病株土樣該酶活性為3種土樣之中最低。脲酶活性以未種植黃連土樣最高，健株土樣次高，病株土樣最低，三者間差異顯著（P<0.05）。蔗糖酶的含量以病株土樣最高，健株土樣次之，未種植黃連土樣最低，三者之間差異顯著（P<0.05），見表2。

2.3 未種植黃連、黃連健株和病株土樣細菌的α多樣性分析 對黃連健株、病株及未種植黃連土樣運用Hiseq2500/PE250測序平臺進行高通量測序，過濾嵌合體后，最終用于后續分析的Effective Tags序列共153 493條，其中健株土樣有54 587條，病株土樣有45 497條，未種植黃連土樣有53 409條，見表3。用于后續分析的Effective tags數目之多，說明采用該方法足以用于3種處理土樣的細菌多樣性分析。

對3種土樣細菌α多樣性指數進行分析表明，未種植黃連土樣細菌的種群多樣性指數（Shannon）顯著高于健株和病株土樣（P<0.05），健株土樣細菌種群多樣性指數顯著高于病株土樣（P<0.05）；從種群豐富度指數（observedspecies，Chao1 和ACE）差異可以看出，未種植黃連土樣的細菌豐富度要高于種植黃連的土樣，罹患根腐病的黃連根際土壤細菌豐富度低于健株和未種植黃連土樣，其中與未種植黃連土樣之間差異顯著（P<0.05），見表4。

2.4 物種稀釋曲線和Veen圖 黃連健株、病株根際土和未種植黃連土壤細菌稀釋曲線比較平坦，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種。從Venn圖可以看出，健康植株土樣（H.RMS）有767個特有的OTUs，未種植黃連土壤特有747個OTUs，而根腐病病株土壤（D.RMS）僅有219個特有的OUTs，見圖1。

2.5 未種植黃連土樣與黃連健株、病株土樣物種相對豐富度分析 未種植黃連和黃連病株、健株土樣細菌在門水平上的豐富度差異比較大。未種植黃連土樣細菌中，按照種群的相對豐度從高到低進行排列，依次是變形菌門（Proteobacteria，38.83%）、酸桿菌門（Acidobacteria，26.19%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，7.65%）、浮霉菌門（Planctomycetes，5.95%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，5.08%）、厚壁菌門（Firmicutes，4.50%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，2.60%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，2.01%）、放線菌門（Actinobacteria，1.50%）、綠彎菌門（Chloroflexi，1.50%）、WS3（1.19%）和泉古菌門（Crenarchaeota，0.37%）；在黃連病株土壤細菌中，相對豐度依次為變形菌門（49.72%）、酸桿菌門（17.81%）、厚壁菌門（5.86%）、擬桿菌門（4.64%）、泉古菌門（4.63%）、疣微菌門（4.38%）、放線菌門（4.01%）、浮霉菌門（2.63%）、芽單胞菌門（1.99%）、綠彎菌門（0.72%）、硝化螺旋菌門（0.44%）和WS3（0.11%）；在黃連健株根際土壤細菌中，相對豐度由高到低依次為：變形菌門（51.34%）、酸桿菌門（16.70%）、擬桿菌門（6.18%）、放線菌門（5.73%）、疣微菌門（5.16%）、芽單胞菌門（3.18%）、浮霉菌門（3.05%）、厚壁菌門（2.62%）、泉古菌門（1.39%）、綠彎菌門（1.20%）、硝化螺旋菌門（0.75%）和WS3（0.23%），見圖2。

差異顯著性分析可知，3個處理土樣中，疣微菌門，擬桿菌門，硝化螺旋菌門，綠彎菌門差異不顯著；未種植黃連土樣中，變形菌門、放線菌門和泉古菌門相對豐度顯著低于2種栽培黃連土樣（P<0.05），厚壁菌門和芽單胞菌門介于健株和病株之間，三者差異不顯著，酸桿菌門、浮霉菌門和WS3在未種植黃連土樣中的相對豐度顯著高于種植黃連土樣（P<0.05）。病株和健株土樣之間酸桿菌門、浮霉菌門和WS3差異不顯著；健株中厚壁菌門、泉古菌門相對豐度顯著高于病株土樣，芽單胞菌門相對豐度顯著低于病株土樣（P<0.05）。

為了更直觀的展現未種植黃連土樣和健株、病株黃連根際土壤細菌種群的相似性及變異，根據所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據其在每個樣本中的豐度信息，從物種和樣品2個層面來聚類，生成熱圖，見圖3。在豐富度排名前35的屬種，僅有Streptomyces在未種植黃連土壤中為0，其余34個屬在3種處理土樣中均有。未種植黃連土壤中細菌的相對豐度較其余2種均高的屬為：DA101，Planctomyces，Nitrospira，Methylibium，Gemmata，Pirellula，Opitutus，Steroidobacter，A17；在健株土樣中，下列屬的相對豐富度高于病株土樣和未種植黃連土樣，分別是：Kaistobacter，Rhodoplanes，Burkholderia，Janthinobacterium，Pseudomonas，Flavobacterium，Chryseobacterium，Sphingopyxis，Sphingomonas，Streptacidiphilus，Pedobacter，Mesorhizobium，Agrobacterium，Cupriavidus。在病株中相對豐度較健株和未種植黃連土樣均高的有：Rhodococcus，Nitrosotalea，Candidatus Koribacter，Rhodanobacter，Candidatus，Solibacter，Oscillospira，Allobaculum，Phenylobacterium，Aquicella，Bacteroides，Ruminococcus，Edaphobacter，Fimbriimonas。

2.6 未種植黃連土樣與黃連健株、病株土樣細菌的β多樣性分析 病株和健株土樣先聚在一起后和未種植黃連的土樣聚在一起，病株土樣細菌種群和健株土樣之間的相異系數為0.205，病株與未種植黃連土樣之間的相異系數為0.352，健株與未種植黃連土樣細菌種群之間的相異系數為0.254。上述結果說明，未種植土樣細菌種群組成與健株之間的相似度大于與病株之間的相似度，同時說明，黃連根腐病顯著改變了黃連根際土細菌種群的組成，見圖4。

3 結論與討論

土壤酶是土壤生態系統中活躍的生物活性物質，在驅動土壤代謝和土壤中養分物質循環及養分的有效釋放過程中起重要作用，是土壤品質和生態系統穩定的重要指標[13]。土壤理化性質和酶活性的變化可以引起植物根際土壤微生物的變化[14]。因此，詳細了解土壤理化性質和酶活性對了解黃連根腐病的發生機制具有重要的意義。土壤脲酶能促進土壤中含氮有機化合物酰胺肽鍵的水解，生成的氨是植物氮素營養的來源之一；蔗糖酶又叫轉化酶，主要參與土壤中碳水化合物的轉化，其活性強弱反應土壤熟化程度和肥力水平，土壤肥力越高其活性

縱向為樣品信息，橫向為物種注釋信息，左側的聚類樹為物種聚類樹，上方的聚類樹為樣品組間的聚類樹；中間熱圖對應的值為每一行物種相對豐度經過標準化處理后得到的Z值，即一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標準差所得到的值。

a.樣品的聚類分析，左側是UPGMA聚類樹結構，右側的是各樣品在門水平上的物種相對豐度分布圖；b. β多樣性指數熱圖，圖中方格中的數字是Weighted Unifrac距離計算出的樣品兩兩之間的相異系數，相異系數越小的2個樣品，物種多樣性的差異越小。

也越強。這2種酶均與土壤礦質營養密切相關，酶活性的高低影響作物可吸收利用的有效營養物質多寡。病株土樣中速效鉀和速效磷含量較健株土樣顯著升高，尤其是速效鉀的3倍量增加，說明病株土壤肥力水平要顯著高于健株土樣，也跟研究中病株土樣蔗糖酶活性的顯著升高相一致。病株土樣中，脲酶活性的降低減少了土壤中含氮有機物酰胺肽鍵的水解，造成了病株土樣中堿解氮的顯著降低。過氧化氫酶能夠減輕土壤中的過氧化氫對生物體的毒害作用。在本研究中，病株土壤的過氧化氫酶活性顯著低于健株土壤和未種植黃連土壤，這就有可能造成黃連植株根部有毒害物質積累過多，對黃連植株產生毒害作用，從而造成根部病害的發生。

有研究表明，有機碳含量高可提高土樣中微生物活性，增加細菌的多樣性[1516]。有機碳含量低，且土壤碳氮比率變小，使得甜菜發生根腐病發生嚴重[17]。在本研究中，有機碳的含量在健康土樣中顯著高于病株和未種植黃連土樣。說明黃連根腐病的發生可能與黃連土壤中有機碳含量的降低有一定的關系。

16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括 10 個保守區域（conserved regions）和 9 個高變區域（hypervariable regions），其中高變區具有屬或種的特異性，隨親緣關系不同而有一定的差異，16S rRNA的V4區是常用的擴增目標區，已經被證實可以很好的用來分析根際土壤的細菌種群多樣性變化[12，1920]及再植性病害土壤分析[21]。

微生物種群的豐富度和變異在土壤質量、功能和土壤生態系統的可持續性發展中扮演著重要的角色[22]。在某種程度上，土壤微生物群落的組成變化、群落類型或者微生物量的變化可以放映出土壤質量的變化[23]。有研究表明，土壤微生物種群豐富度的降低和變異性的降低可能跟連作障礙[24]和植株罹患病害有一定的關系[25]，Yang 等[26]也發現，健康植株根際土壤的細菌多樣性顯著高于發病植株。在種植了黃連的2種處理土樣中，健康植株的根際土細菌種群豐富度和多樣性要高于罹患根腐病的土樣。因此，在本研究中，根腐病病株根際土樣較健株土樣和未種植黃連土樣的細菌種群豐富度和多樣性的降低，可能是誘導黃連罹患根腐病的一個重要原因。

在種植黃連土樣中，健株和病株土樣中變形菌門、酸酐菌門、放線菌門、疣微菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、消化螺旋菌門、綠彎菌門和WS3差異不顯著；根腐病病株土壤中厚壁菌門和泉古菌門的相對豐度顯著高于健株土樣，而芽單胞菌門的相對豐度則顯著低于健株土樣（P<0.05）。在黃連健株土樣細菌屬中，伯克氏菌屬Burkholderia等14個屬的相對豐度較病株和未種植黃連土樣高，其中，假單胞菌屬Pseudomonas[2728]、伯克氏菌屬[2931]、土壤桿菌屬Agrobacterium[30]、黃桿菌屬Flavobacterium[32]中的一些種已被證明是具有生防和促生作用的有益菌群。但是，這幾個屬也是植物常見病原細菌較為集中的屬[33]，黃連健株土樣中的這幾個屬對植物生長是促進還是抑制，可能決定于這些細菌在根際土壤中代謝產物的濃度，因此，在沒有經過體外試驗，盆栽和大田試驗的嚴格篩選之前，不能肯定上述屬就是造成黃連根腐病發生的一個重要因素。

有研究表明，黃連須根浸提液對細菌起到一定的抑制作用[34]，黃連根系分泌的酚酸類物質也是影響黃連細菌數量的一個重要原因[35]。在本研究中，未種植黃連的土壤中，細菌的種群多樣性顯著高于種植過黃連的土樣，種群的細菌豐富度也高于種植過黃連的土樣。也就是說，黃連的種植，降低了黃連種植土壤細菌種群豐富度和多樣性。在對3種處理土樣中豐富度排名前12門進行比較分析可知，未種植黃連的土樣細菌中變形菌門，放線菌門和泉古菌門相對豐度顯著低于2種栽培黃連土樣，酸桿菌門，浮霉菌門和WS3在未種植土樣中的相對豐度顯著高于種植黃連土樣。栽培黃連是通過什么途徑改變了這6個細菌門在土壤中的相對豐度，是黃連根際分泌或者是植株在自然條件下的降解物，亦或者是人工栽培措施（施肥等）改變了連田的土壤細菌群落，是下一步值得深入研究的課題。

總之，本研究表明，黃連種植造成了土壤中pH值、速效磷、脲酶的顯著降低和蔗糖酶的顯著升高，未栽培黃連土樣中變形菌門、放線菌門、泉古菌門的豐度顯著低于2種栽培土樣，酸桿菌門、WS3則顯著高于2種栽培土樣。黃連根腐病土樣中，有機碳、過氧化氫酶活性和細菌種群豐度的顯著降低及細菌種群多樣性的降低有可能是造成黃連根腐病的重要原因，但是，黃連根腐病發生的原因比較復雜，僅僅從土壤養分、酶活變化及土壤根際細菌多樣性變化的角度來解釋缺乏充分的理論依據，黃連化感物質的種類，化感物質跟土壤微生物之間的關系也值得深入研究。

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[責任編輯 呂冬梅]