蒙花苷與木犀草素聯用對離體血管的舒張作用及其機制研究

楊耀　陳波　梁凱倫　蘇潔　陳素紅　呂圭源

[摘要] 為研究蒙花苷與木犀草素聯用對SD大鼠離體血管環的舒張作用及其作用機制。采用離體血管環張力實驗觀察蒙花苷單用（7.5×10-6 g·mL-1）、木犀草素單用（7.5×10-6 g·mL-1）、蒙花苷與木犀草素聯用（1∶4）對去甲腎上腺素引起的SD大鼠完整、去內皮、LNAME及吲哚美辛預處理胸主動脈收縮的影響；Western blot檢測胸主動脈pAkt，peNOS等蛋白水平。實驗結果顯示，蒙花苷與木犀草素聯用對完整、去內皮及LNAME預處理的血管環舒張率高于兩者單用；且兩者聯用能顯著促進血管中pAkt，peNOS蛋白表達。實驗結果說明蒙花苷與木犀草素聯用能有效舒張血管，其機制可能是通過激活PI3K/Akt/NO信號通路，增強eNOS活性，從而增加NO的合成與釋放，達到舒張血管的作用。

[關鍵詞] 蒙花苷； 木犀草素； 聯用； 血管舒張； 機制； 高血壓

Relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on isolated

vessels in vivo and its mechanism

YANG Yao1， CHEN Bo1， LIANG Kailun1， SU Jie1， CHEN Suhong2*， LV Guiyuan1*

（1.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；

2.Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] To study the relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on aortic rings in SD rats and its mechanism. The effect of buddleoside alone（7.5×10-6g·mL-1）， luteolin alone（7.5×10-6g·mL-1） and the combination of buddleoside and luteolin（1∶4） on norepinephrineinduced contractility of complete， endotheliumdenuded， and LNAME and indomethacinpretreated thoracic aorta in SD rats were observed in the in vitro ring tension test. Western blot was used to detect pAkt and peNOS protein expressions in the thoracic aorta. The experimental results showed that buddleoside combined with luteolin could significantly increase the relaxation rate of blood vessels and endothelium and LNAMEpretreated vascular rings compared with the two single administrations. And buddleoside combined with luteolin could also significantly increase pAkt and peNOS protein expressions.The results suggested that the combination of buddleoside and luteolin could effectively relax the blood vessel， and the mechanism may be to increase the synthesis and release of NO and reach the role of relaxing blood vessel by activating PI3K/Akt/NO signaling pathway and enhancing the activity of eNOS.

[Key words] buddleoside； luteolin； combination； vasorelaxation； mechanism； hypertension

高血壓病是以動脈血壓增高為主要臨床表現，是嚴重危害人類健康的常見病；絕大多數高血壓患者均有不同程度的血管內皮功能障礙，而血管內皮結構和功能的改變又會促進高血壓的發展[1]。高血壓的發病機制與神經內分泌免疫網絡密切相關，是整體調節共同作用的結果；中醫藥具有多成分、多靶點優勢，能有效改善血管內皮功能，舒張血管達到降壓的作用[2]。

野菊花是菊科植物菊花Chrysanthemum indicum的干燥頭狀花序，是一種常用的治療高血壓中藥[3]；植物化學研究表明，菊花富含木犀草素和蒙花苷等多種黃酮類化合物，且木犀草素和蒙花苷被認為是其最重要的降壓活性成分[4]。木犀草素（luteolin，LUT）是一種常見的黃酮類化合物，存在于許多類型的植物中，且已被用于中國傳統醫學治療多種疾病，如高血壓、炎癥性疾病和癌癥等[58]。蒙花苷（buddleoside，BUD）是中藥野菊花中主要的活性化合物，具有抗炎、鎮痛、發汗、降血壓、抗應激、焦慮、解熱等活性[9]。已有研究表明木犀草素血管舒張作用的結構活性關系[10]；而蒙花苷對于血管損傷的保護研究甚少。本課題組前期研究表明，蒙花苷與木犀草素聯用對于自發性高血壓模型大鼠（SHR）的高血壓治療有明顯的聯用增效作用，能顯著降低SHR大鼠的收縮壓與舒張壓，降低SHR大鼠血清中內皮素（endothelin，ET）的釋放和增加血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的水平[11]，提示其作用機制可能與舒張血管相關。因此，本文采用離體大鼠胸主動脈環模型，觀察研究木犀草素、蒙花苷及其聯用的舒張血管作用及其機制。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠24只，雄性，體重220～400 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（浙）20140001。

1.2 試劑 蒙花苷（76.01%，實驗室自制）；木犀草素（98%，南京澤朗）；重酒石酸去甲腎上腺素注射液（NE，批號130803，上海禾豐制藥有限公司）；氯化乙酰膽堿（Ach，≥98.0%，上海信帆生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma分裝，批號WS20130112，上海西唐科技有限公司）；吲哚美辛（indomethacin）、左旋硝基精氨酸甲酯（Lnitro arginine methyl ester，LNAME）均購自美國Sigma公司。RIPA蛋白裂解液、ECL化學發光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）；磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抗體（pAkt，CST公司），磷酸化一氧化氮合酶抗體（peNOS，CST公司），GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）以及葡萄糖（Glucose）均為國產分析純化學試劑。

1.3 儀器 離體血管灌流實驗系統（上海奧爾科特生物科技有限公司）；張力換能器（上海奧爾科特生物科技有限公司）；ALCMPA2000m生物信號采集處理系統（上海奧爾科特生物科技有限公司）；電熱恒溫水槽（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Powerwave340酶標儀（美國BIOTEK）；MICROCL17微量離心機（美國Thermo）；化學發光成像儀（MiniChemiⅡ，北京賽智創業科技有限公司）。

2 方法

2.1 KrebsHenseleit solution液（KH液）配制 A液：MgSO41.2 mmol·L-1；B液：CaCl21.8 mmol·L-1，NaCl 118.1 mmol·L-1；C液：KCl 4.7 mmol·L-1，NaHCO325 mmol·L-1，KH2PO41.63 mmol·L-1；glucose 10.0 mmol·L-1。取A，B母液各50 mL，C母液100 mL，葡萄糖2 g，加去離子水定容到1 000 mL，用pH計和HCl調至pH 7.4，現配現用（新鮮配制，每只大鼠約需500 mL）。

2.2 離體主動脈環的制備 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，剪開胸腔，迅速游離胸主動脈，置于KH液中漂洗。小心剪除血管周圍的脂肪和結締組織，將主動脈剪成3～5 mm的血管環。根據實驗需要，采用機械法，用棉簽摩擦血管環內表面去除內皮細胞，將部分血管環制備成去內皮的模型。

2.3 離體主動脈環固定 將血管環懸掛于經37 ℃預熱，容量為10 mL的浴槽內，一端固定，一端通過張力換能器連接生物信號采集系統，在持續通和95% O25%CO2混合氣體的狀態下，逐漸調節其基礎張力至2 g，并在37 ℃下穩定60 min，其間每15 min換液1次。用1 μmol·L-1NE收縮血管環達峰值，加入濃度為10 μmol·L-1Ach，通過血管舒張的程度檢驗血管內皮完整性。以1 μmol·L-1NE誘發最大收縮幅度為100%，以加入舒張藥物后的血管張力變化幅度與NE誘發最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。

2.4 BUD，LUT和兩者聯用對血管環的舒張作用 取內皮完整或去內皮的血管環，分為對照組、BUD單用組（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT單用組（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT聯用組（1∶4）；各組藥物預先孵育15 min后，加入1 μmol·L-1NE收縮血管環，觀察不同受試藥對血管的舒張作用；對照組以等量KH液代替受試藥加入。實驗結束后，將各組血管環迅速取下，保存于液氮中。

2.5 BUD，LUT和兩者聯用對不同拮抗劑預處理的血管環的舒張功能的影響 取內皮完整血管環，血管環穩定后，分為對照組、BUD單用組（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT單用組（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT聯用組（1∶4）；分別以 0.1 mmol·L-1LNAME預處理血管環15 min或10 μmol·L-1吲哚美辛預處理血管環20 min；再加入相應的藥物與血管環共孵育15 min，最后加入1 μmol·L-1NE收縮血管環，觀察不同受試藥對血管的舒張作用；對照組以等量KH液代替受試藥加入。實驗結束后，將各組血管環迅速取下，保存于液氮中。

2.6 BUD，LUT和兩者聯用保護離體大鼠血管環pAkt，peNOS蛋白表達 取上述各實驗保存的離體大鼠血管環組織，經液氮研磨后，加入RIPA蛋白裂解液，提取組織蛋白，然后用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離后，轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%的脫脂奶粉溶液，在搖床上室溫封閉2 h，加入不同一抗：pAkt（1∶1 000），peNOS（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入相應二抗，室溫下孵育1 h，PBST洗滌3次。反應信號經ECL化學發光液檢測，結果MiniChemi Ⅱ凝膠成像儀采集圖像，分析結果。

2.7 統計處理 實驗數據用±s表示，采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，統計學方法為單因素方差分析（Oneway ANOVA）并做多重比較（LSD法），P<0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 BUD，LUT和兩者聯用對內皮完整和去內皮血管環的舒張作用 在內皮完整血管環上，BUD和LUT單用及兩者聯用均可顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯用舒張率更大（P<0.05或P<0.01）；在去內皮血管環上，除BUD單用外，LUT單用及兩者聯用同樣地均可顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯用舒張率更大（P<0.01）；與內皮完整血管環相比，在去內皮血管環上，BUD，LUT單用及兩者聯用的舒張率均減小，但僅BUD單用引起的舒張率具有統計學差異（P<0.01），見圖1。

3.2 BUD，LUT和兩者聯用對LNAME預處理血管環舒張作用的影響 LNAME預處理血管環后，LUT單用和兩者聯用能顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯用舒張率更大（P<0.01）；與未經LNAME預處理的血管環相比，BUD，LUT和兩者聯用對LNAME預處理的血管環的舒張率均顯著降低（P<0.01），見圖2。

3.3 BUD，LUT和兩者聯用對吲哚美辛預處理血管環舒張作用的影響 吲哚美辛預處理血管環后，LUT單用和兩者聯用能顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯用舒張率更大（P<0.01）；與未經吲哚美辛預處理的血管環相比，BUD，LUT單用和兩者聯用對吲哚美辛預處理的血管環的舒張率無統計學差異，見圖3。

3.4 BUD，LUT和兩者聯用對離體大鼠血管環pAkt，peNOS蛋白表達的影響 BUD，LUT單用及兩者聯用能顯著增加完整血管環和去內皮血管環組織中的pAkt，peNOS蛋白水平，且聯用效果更好；LNAME預處理的血管環后，血管環組織中pAkt，peNOS蛋白水平顯著降低，BUD，LUT單用及兩者聯用能不同程度增加LNAME預處理血管環組織中pAkt，peNOS蛋白水平的表達，且聯用效果更好。而BUD，LUT單用及兩者聯用對經吲哚美辛預處理的血管環組織中pAkt，peNOS蛋白水平的表達無明顯影響，見圖4。

4 討論

近年來，通過動物實驗及體外細胞研究表明，多種中藥及有效成分可通過降血脂、抗氧化損傷、調節內皮細胞活性物質分泌、抗細胞凋亡等達到保護血管內皮功能的目的[12]。中藥治療血管內皮功能障礙相關性疾病具有獲得方便、價格低廉、容易被人們接受的獨特優勢。雖然中藥抗血管內皮損傷的部分作用機制研究已有報道，但中藥復方、提取物的多靶點作用途徑仍需重視，大量研究僅涉及內皮細胞的各種分泌因子在中藥藥理作用下的變化，卻未能闡明其調節的環節和方式。因此，研究具有血管內皮細胞保護作用的中藥及中藥復方藥物對心血管疾病的防治研究具有重要意義。

高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛等多種心血管疾病狀態下的血管內皮功能障礙的主要原因有eNOS合成/活性的降低，NO生成的減少；血管活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產生，O2-與NO反應生成ONOO-，導致NO的生物利用度降低；以及脂質過氧化和抗氧化能力的降低[13]。ET和NO平衡失調是內皮功能障礙的主要原因之一。NO是一種高度活躍的自由基，并具有舒張血管的功能，它以左旋精氨酸（LArg）為底物，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化生成[14]。血管內皮上的NO/內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）系統在調節血管舒縮功能中發揮著重要作用[15]。PI3K/Akt信號通路的活化能促進內皮細胞的存活和血管生成[16]。蛋白激酶Akt是一種調節細胞存活、生長和糖代謝的多功能調節器；就其心血管功能，Akt激活下游血管生長因子血管內皮生長因子（VEGF）和促血管新生蛋白因子使內皮細胞存活和確保血管生成[1718]。除此之外，Akt還具有磷酸化eNOS絲氨酸1179或1177位點的能力，誘導內皮細胞NO的生成，從而控制血管舒縮功能[19]。

木犀草素具有廣泛的生物活性和藥理作用[2023]。已有研究表明木犀草素保護大鼠心臟組織缺血再灌注損傷通過抑制誘導型一氧化氮合酶表達，降低NO的產生，然后阻止NO與超氧陰離子自由基的作用，從而防止氧化損傷[24]。另有研究發現木犀草素保護缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷是通過改善心肌收縮功能，抑制氧化應激，以及激活PI3K/Akt信號通路[25]。且本實驗室前期研究表明，蒙花苷與木犀草素聯用對于自發性高血壓模型大鼠的高血壓治療有明顯的聯用增效作用，能降低SHR大鼠血漿中ET的釋放和增加NO水平[11]。

本實驗采用離體血管環模型，研究發現BUD與LUT聯用能舒張NE引起的血管收縮，對完整及去內皮的離體血管環的舒張率均高于BUD和LUT單用組，且去內皮血管環的舒張率低于完整血管環；經LNAME預處理，抑制血管環內皮eNOS的活性后，血管環的舒張率均顯著低于完整血管環，BUD與LUT聯用能顯著升高LNAME預處理后的血管環的舒張率，且顯著高于BUD和LUT的單用；而經吲哚美辛預處理，抑制血管環內皮環氧合酶2的活性后，血管環的舒張率與完整血管環的舒張率相比，無明顯差異；且BUD，LUT單用及聯用引起的血管環舒張率與完整血管環的舒張率相比，無明顯差異。Western blot結果顯示經去內皮、LNAME預處理后，peNOS的表達明顯低于完整血管環；經吲哚美辛預處理后，peNOS的表達與完整血管環相比無明顯差異。BUD與LUT聯用均能促進各組血管環中pAkt，peNOS蛋白水平的表達，并明顯優于BUD及LUT單用。上述結果提示BUD與LUT聯用舒張血管的方式是內皮依賴性舒張作用，且可能是通過增強血管內皮eNOS的活性，從而舒張NE引起的血管收縮。

綜上所述，BUD與LUT聯用舒張血管的作用機制可能是通過PI3K/Akt/NO信號通路，促進eNOS磷酸化而激活eNOS的活性，從而增加內皮NO的合成與釋放，達到舒張血管的作用。此外，該研究對于解釋中藥配方的強大優勢，相對于單味藥的應用，多味藥聯合應用產生的更可靠和更強大的效果具有重要的意義。

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[責任編輯 張寧寧]