不同濃度重鉻酸鉀溶液脅迫對洋蔥根尖生理生化特性的影響

李秋江++趙云霞++謝雅舒++王星皓++馬亞洪++李嘉文++宋桂芹

摘要：研究不同濃度重鉻酸鉀溶液及不同處理時間對洋蔥（Allium cepa L.）根尖細胞有絲分裂和植物保護酶系統的影響，旨在為探究重金屬鉻作用于植物體的生理生化機理提供參考。分別用0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重鉻酸鉀溶液處理洋蔥根尖6、12、18、24 h，而后收集洋蔥根尖組織，分別用于洋蔥根尖組織石蠟切片、蘇木素染色觀察和測定根尖細胞中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉移酶活性及丙二醛含量。結果表明，不同濃度重鉻酸鉀溶液處理洋蔥根尖不同時間后，細胞有絲分裂出現異常分裂，并伴有微核的產生；無論處理時間長短，隨著處理濃度的增加，細胞中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉移酶活性都呈現先上升、后下降的變化趨勢，而丙二醛含量先緩慢下降、后迅速上升；當處理濃度一定時，隨著處理時間的延長，細胞中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S轉移酶活性呈上升趨勢，而丙二醛含量呈緩慢下降趨勢。說明重鉻酸鉀溶液對洋蔥具有一定的細胞毒性作用，可能與調控細胞中各種酶系統的活性及含量有關。

關鍵詞：洋蔥（Allium cepa L.）；重鉻酸鉀；超氧化物歧化酶（SOD）；過氧化氫酶（CAT）；谷胱甘肽-S轉移酶（GST）；丙二醛（MDA）

中圖分類號：S633.2+78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1489-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.022

Effects of Different Concentration of K2Cr2O7 Solution Stress on the Physiology and Biochemistry of the Tip Cell of Allium cepa

LI Qiu-jiang，ZHAO Yun-xia，XIE Ya-shu，WANG Xing-hao，MA Ya-hong，LI Jia-wen，SONG Gui-qin

（The Department of Biology of North Sichuan Medical College， Nanchong 637000， Sichuan， China）

Abstract： To provide references for exploring the physiological and biochemical mechanisms of chromium ions on plants， the effects of potassium dichromate（K2Cr2O7） with different treatment time on the mitosis and plant protection enzyme system of root tip cells of Allium cepa L. were studied. K2Cr2O7 solutions with different concentration were used separately to treat the root tip of A. cepa for 6， 12， 18， 24 h. The A. cepa root tip tissue were collected for tissue paraffin sections， hematoxylin and testing the activity of SOD， CAT， GST and the content of MDA. After the tip cell being prosessed by K2Cr2O7 solution with different concentration for different time， abnormal mitotic cell division and micronucleus were found in mitotic cells. No matter the length of processing time， with the increase of K2Cr2O7 concentration， the activity of SOD， CAT， GST in cell increased at first and then decreased； but the content of MDA decreased slowly at first and then increased rapidly. When the K2Cr2O7 solution concentration was constant， with the extension of treatment time， the activity of SOD， CAT， GST in cell showed an increasing trend； while the content of MDA decreased slowly. Potassium dichromate solution had certain toxic effects on A. cepa cell， which may be related to regulating the activity and the content of various enzyme systems in cell.

Key words： Allium cepa L.； potassium dichromate solution； SOD； CAT； GST； MDA

隨著人類社會經濟的發展，環境污染尤其是農田生態環境污染成為社會最關心的問題。造成農田生態環境污染的重金屬有鎘（Cd）、鉛（Pb）[1]、汞（Hg）、砷（As）、鉻（Cr）、銅（Cu）、錳（Mn）[2，3]及鋅（Zn）等，而鉻是其中最重要的污染源。鉻作為最主要的重金屬污染物，對動植物均有一定的毒害作用，其中對植物毒害最大的主要是六價鉻，其絕大部分可被植物根部吸收，造成植物的畸形與突變[4]。植物在正常的生長代謝過程中，耗氧是必不可少的，同時體內會產生大量的自由基、過氧化物、活性氧等有害物質。這些有害物質對細胞膜有一定的破壞作用，并且大量長期存在于植物體內會影響植物的正常生長代謝，對植物產生嚴重的毒害作用[5]。但是植物本身對這些有害物質有一定的清除能力，因此正常情況下，自由基的產生與消除處在一種動態平衡的狀態[6，7]。然而重金屬可在土壤中長期存留，不易降解；長時間的重金屬蓄積將打破植物的動態平衡狀態，加速體內自由基的積聚，延緩自由基的清除，長此以往將造成植物出現一種不可逆的損傷，最終導致植物死亡。超氧化物歧化酶（SOD）[8]、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽-S轉移酶（GST）[9]屬于植物體內的保護酶系統，可清除自由基，從而對機體起著保護作用。微量丙二醛（MDA）能延緩自由基的清除，起著破壞作用。近年來重金屬對植物機體的毒害作用報道不少，但是通過檢測重金屬脅迫后植物機體中各種酶系統活性而更直接反映其毒害程度的報道較少。因此，試驗開展了這方面的探討，以期深入闡述重金屬對植物毒害的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 植物材料選擇洋蔥（Allium cepa L.），在2015年夏季購于南充市當地的市場，參試樣品大小均勻，生長狀況良好，未使用任何藥物處理。將洋蔥隨機分為試驗組和對照組，試驗組分別用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L重鉻酸鉀（K2Cr2O7，四川科倫藥業股份有限公司生產）溶液處理，對照組全程用去離子水處理。

1.1.2 洋蔥的培養 將買來的洋蔥取根尖，洗凈后剝去老皮，去離子水清洗處理，待根尖長至2～3 cm后，換用不同濃度的重鉻酸鉀溶液分別處理6、12、18、24 h，然后剪下根尖組織，分別用于石蠟切片制作和酶活性的測定。

1.1.3 儀器與試劑 儀器主要有正立熒光顯微鏡、石蠟包埋機與輪轉切片機（德國徠卡儀器有限公司）；還有酶標儀（美國BIO-RAD公司）、721分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；試劑主要有乙醇、甲醛、醋酸、蘇木素等，SOD、CAT、GST、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，貨號分別為A001-3、A007-1、A004、A003-2。

1.2 方法

1.2.1 洋蔥根尖石蠟切片 分別選取不同濃度、不同時間處理后的洋蔥根尖組織3根置于FAA固定液（配置比例為38%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）中固定2～3 d，經過脫水、浸蠟、透明等步驟包埋切片。采用蘇木素染色，顯微鏡下觀察細胞有絲分裂情況。

1.2.2 SOD、CAT、GSH活性及MDA含量測定 分別選取不同濃度、不同時間處理后的長度為2～3 cm洋蔥根尖10根，測其總重量，碾碎。根據試劑盒說明書的步驟，以10根根尖的總酶活性作為統計指標結果。用分光光度計檢測CAT、GSH活性及MDA含量，用酶標儀檢測SOD活性。

1.3 數據處理

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2010程序處理，并用其制表和繪圖；運用SPSS 11.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 重鉻酸鉀溶液及處理時間對洋蔥根尖細胞有絲分裂染色體的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液及不同處理時間對洋蔥根尖細胞有絲分裂染色體的影響情況見圖1。從圖1可見，重鉻酸鉀溶液處理后，洋蔥根尖細胞形態不一，細胞核也不規則；有的細胞在分裂過程中出現了不對稱分裂、染色體橋、染色體滯后、不同步分裂等現象，各處理均形成了微核，有微核效應，還有的細胞在分裂過程中紡錘絲被打斷，也可能出現微核，但是微核率各不相同。而對照組無微核現象產生。

2.2 重鉻酸鉀溶液及處理時間對洋蔥根尖細胞SOD活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對洋蔥根尖細胞SOD活性的影響情況見圖2，不同處理時間對洋蔥根尖細胞SOD活性的影響情況見圖3。從圖2、圖3可見，無論處理時間的長短，洋蔥根尖細胞中SOD活性隨著重鉻酸鉀溶液濃度的增加都呈現先上升、后下降的變化趨勢，均在25.0 mg/L處理達到峰值。且處理6、12、18、24 h后的SOD活性在25.0 mg/L處理明顯上升，而在低濃度脅迫下，隨著處理時間的延長，洋蔥根尖細胞中SOD活性的增加并不明顯；高濃度脅迫下，隨著處理時間的延長SOD活性增加明顯。

2.3 重鉻酸鉀溶液及處理時間對洋蔥根尖細胞CAT活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對洋蔥根尖細胞CAT活性的影響情況見圖4，不同處理時間對洋蔥根尖細胞CAT活性的影響情況見圖5。從圖4、圖5可見，洋蔥根尖處理12、18、24 h后，細胞中的CAT活性隨著重鉻酸鉀溶液濃度的增加呈現先上升、后下降的變化趨勢，上升的趨勢較下降緩慢，在25.0 mg/L處理后達到最大值，但是處理6 h后的CAT活性變化不大。隨著處理時間的延長，對照的變化不明顯，其他處理呈現上升的趨勢，當處理濃度為12.5、25.0 mg/L時，變化較高濃度處理的明顯。

2.4 重鉻酸鉀溶液及處理時間對洋蔥根尖細胞GST活性的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對洋蔥根尖細胞GST活性的影響情況見圖6，不同處理時間對洋蔥根尖細胞GST活性的影響情況見圖7。從圖6、圖7可知，在低濃度重鉻酸鉀溶液脅迫下，細胞中的GST活性緩慢上升，隨著處理濃度的進一步增加，細胞中GST活性出現緩慢下降。當處理時長為6、18、24 h時，細胞中的GST活性均在25.0 g/mL處理達到峰值，而當處理時長為12 h時，細胞中GST活性在50.0 g/mL處理的活性最強。在處理濃度相同的條件下，隨著處理時間的延長，低濃度脅迫下的細胞中GST活性增加明顯，高濃度脅迫下GST活性變化并未呈現一定的規律。

2.5 重鉻酸鉀溶液及處理時間對洋蔥根尖細胞MDA含量的影響

不同濃度重鉻酸鉀溶液處理對洋蔥根尖細胞MDA含量的影響情況見圖8，不同處理時間對洋蔥根尖細胞MDA含量的影響情況見圖9。從圖8、圖9可見，隨著處理濃度的增加，細胞中MDA含量均呈現先緩慢下降、后迅速升高的變化。在25.0 g/mL處理達到最小值。當處理濃度相同時，除重鉻酸鉀溶液濃度為12.5、25.0 mg/L無明顯變化規律外，其他各處理隨著時間的延長，細胞中MDA含量緩慢下降。

3 討論

科技的進步給人們生活提供了不少便利，但是也給環境造成了不同程度的損害，重金屬污染就是其中之一。重金屬在生物體內蓄積而不被降解的特性最終導致了生物體的畸變與變異。試驗中在不同濃度重鉻酸鉀溶液毒害下，洋蔥根尖細胞出現了染色體橋、染色體不同步甚至導致了微核的形成等變異現象[10，11]，印證了鉻作為環境中毒害性較大的重金屬元素對植物有一定的毒害作用，可以誘導植物的畸變與突變[12，13]；但是不同濃度、不同時間處理后洋蔥根尖細胞有絲分裂過程中的微核率差別不大，也與油菜根尖細胞的微核率和染色體畸變率在一定脅迫濃度范圍內呈現先上升、后下降的趨勢[14]不符合，可能是由于植物種類的不同造成的。產生細胞染色體畸變的原因有很多[15]，其中主要的原因是直接抑制DNA分子，破壞了DNA分子結構，或者抑制了DNA分子向RNA分子和蛋白質的轉變過程，最終導致染色體的變異；此外，還可以直接作用于染色體的分離過程，導致染色體的重排、滯后以及染色體橋的形成，滯后的染色體單獨成型導致單微核、雙微核的形成[16]。因此，可以通過計算細胞微核率來間接反映重金屬等對細胞的毒害程度[17]。試驗中，細胞出現了染色體片段的斷裂以及染色體橋的形成，說明鉻元素可能是作用于染色體的DNA分子而發揮毒害作用的，但是具體的毒害機理還需進一步的驗證。

重鉻酸鉀溶液對洋蔥的脅迫除了通過作用于蛋白質使蛋白質變性、從而改變細胞的膜功能外，還可以通過破壞洋蔥體內的保護酶系統（SOD、CAT、GST）導致細胞內活性氧代謝障礙，使自由基積聚，從而造成洋蔥出現不可逆的損傷[18]。鉻元素對洋蔥的生理生化反應呈現二重性，在低濃度作用下有一定的刺激作用。在重金屬輕度脅迫下，植物會由于應激本能而產生保護作用，通過加速體內的新陳代謝來緩解重金屬的毒害作用，但同時體內代謝功能的增強也會加速重金屬進入體內，進而加重重金屬的毒害。當重金屬脅迫作用進一步加大后，植物本能應激產生的保護作用減弱，重金屬的毒害加重，最終導致植物出現不可逆的損傷。試驗結果表明，在低濃度時，SOD、CAT、GST活性增強，其原因是由于此時相比重金屬的毒害作用，洋蔥應激產生的保護作用占優勢；而高濃度時，SOD、CAT、GST活性受到抑制則是洋蔥受到重金屬鉻元素持續的毒害作用所致。這與以往報道的研究結果[19]相符合。隨著處理時間的延長，細胞中SOD、CAT、GST活性增強，表明在處理時間為6～24 h之內，洋蔥可以通過加速體內的代謝來緩解重金屬鉻的毒害作用。

丙二醛（MDA）是細胞內膜脂過氧化或脫脂過程的產物，它會嚴重損傷細胞的生物膜，而膜脂過氧化是在膜脂不飽和脂肪酸中發生的一系列自由基反應[20]。有研究發現，膜脂過氧化會導致大量活性氧自由基的產生，破壞細胞膜結構功能的穩定性[21]。本試驗中，洋蔥根尖細胞隨著處理鉻濃度的上升，其MDA含量呈現先緩慢下降、后急劇上升的變化趨勢，其中MDA含量緩慢下降主要是由于有機酸產生體外解毒效果，使體內各種保護酶活性增強，加速了清除活性氧自由基的過程，削弱了膜脂過氧化作用，從而減少了MDA在體內的累積；其次是機體內保護酶系統（SOD、CAT、GST）受到抑制后，也可表現出MDA含量的降低；而MDA含量上升則是細胞膜脂過氧化作用強化的結果。這個結果與楊文玲等[21]報道的情況相類似。

試驗結果表明，洋蔥根尖受到重金屬鉻脅迫后，細胞有絲分裂過程會有染色體橋、染色體不同步甚至微核等現象的產生，最終導致細胞異常分裂、生物畸變的形成；而這種異常分裂機制與機體內酶系統（SOD、CAT、GST）活性及MDA含量的變化有著密切關系。但是重金屬鉻脅迫具體是通過何種途徑對洋蔥的酶系統產生影響還不是很清晰，而且影響植物酶系統的機理相對較復雜，還有待于下一步深入研究。

參考文獻：

[1] JIANG Z，ZHANG H，QIN R，et al. Effects of lead on the morphology and structure of the nucleolus in the root tip meristematic cells of Allium cepa L.[J]. Int J Mol Sci，2014，15（8）：13406-13423.

[2] 蘇銀萍，劉 華，于方明，等. Mn污染對木荷葉片抗氧化酶系統的影響[J].農業環境科學學報，2014，33（4）：680-686.

[3] CLAUS H B，KIM J，WESSLING R M，et al. Associations of iron metabolism genes with blood manganese levels：A population-based study with validation data from animal models[J].Environ Health，2011，10：97-106.

[4] SINHA S，GUPTA A K，BHATT K. Uptake and translocation of metals in fenugreek grown on soil amended with tannery sludge： Involvement of antioxidants[J].Ecotoxicol Environ Saf，2007，67（2）：267-277.

[5] SHAHID M，POURRUT B，DUMAT C，et al. Heavy-metal-induced reactive oxygen species：Phytotoxicity and physicochemical changes in plants[J].Rev Environ Contam Toxicol，2014，232：1-44.

[6] 徐美燕.鎘、鉻脅迫以及硒對水稻幼苗生理生化影響的研究[D].廣西桂林：廣西師范大學，2007.

[7] 羅 婭，湯浩茹，張 勇.低溫脅迫對草莓葉片SOD和AsA-GSH循環酶系統的影響[J].園藝學報，2007，34（6）：1405-1410.

[8] 董 亮，何永志，王遠亮，等.超氧化物歧化酶（SOD）的應用研究進展[J].中國農業科技導報，2013，15（5）：53-58.

[9] 裘波音.水稻鉻脅迫耐性的遺傳分析與還原型谷胱甘肽緩解鉻毒害的機理研究[D].杭州：浙江大學，2012.

[10] 張競秋，高文萱，劉 欣.2，4-D丁酯對小麥根尖細胞有絲分裂染色體畸變的影響[J].東北農業大學學報，2013，44（10）：14-17.

[11] 楊 銘，張利紅，楊 麗，等.鉛脅迫對蠶豆根尖有絲分裂染色體畸變的研究[J].寧夏農林科技，2013，54（9）：58-59，71.

[12] CHAPARZADEH N，D'AMICO M L，KHAVARI-NEJAD R A， et al. Antioxidative responses of Calendula officinalis under salinity conditions[J].Plant Physiol Biochem，2004，42（9）：695-701.

[13] 薩娜瓦爾，艾比布拉，阿依努爾，等.NaCl脅迫對鷹嘴豆根尖細胞有絲分裂的影響[J].安徽農業科學，2015，43（16）：8-10.

[14] 高 揚，辛樹權，楊 宗.重鉻酸鉀對大蒜根尖細胞有絲分裂的影響[J].安徽農業科學，2009，37（28）：13557-13559，13573.

[15] 高 揚，韓德復，于海芹.硒對大蒜根尖細胞有絲分裂影響的初探[J].長春師范學院學報，2007，26（4）：54-57.

[16] 趙錦慧，張永亮，周 琳.化學誘變劑對玉米種子萌發及根尖細胞分裂和染色體的影響[J].周口師范學院學報，2014，31（5）： 92-95.

[17] 高 揚，陳鳳艷，何正飚.硒對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響[J].通化師范學院學報，2003，24（2）：22-25.

[18] 宋相帝，呂金印，邸麗俊，等.鉻脅迫對青菜（Brassica chinensis L.）植物螯合肽含量及抗氧化特性的影響[J].農業環境科學學報，2011，30（5）：843-848.

[19] 許耀照，曾秀存，方 彥，等.鹽堿脅迫對油菜種子萌發和根尖細胞有絲分裂的影響[J].干旱地區農業研究，2014，33（4）：14-19.

[20] 胡 澍，焦菊英，杜華棟，等.黃土丘陵溝壑區不同立地環境下植物的抗氧化特性[J].草業學報，2014，23（5）：1-12.

[21] 楊文玲，鞏 濤，劉瑩瑩，等.鉛鉻脅迫對小麥幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響[J].中國農學通報，2015，31（6）：45-50.