乙氧氟草醚對泥鰍的毒性研究

夏曉華++霍蔚然++李墨溢++董慧++夏曉培++杜啟艷++常重杰

摘要：為了檢測除草劑乙氧氟草醚對水生生物的毒性，以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）為試驗對象，通過急性毒性試驗、微核試驗、單細胞凝膠電泳試驗，來檢測其對泥鰍的毒性效應。結果表明，乙氧氟草醚對泥鰍在24、48、72、96 h的半數致死濃度（LC50）分別為36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，安全濃度（SC）為7.92 mg/L。微核率和核異常率均隨著染毒濃度的增加和時間的延長不斷升高，呈現明顯的時間劑量效應關系。在處理6 d的最高濃度，微核率和核異常率達到最大，分別為6.417‰±0.631‰和65.417‰±5.080‰。單細胞凝膠電泳試驗中，選取彗尾DNA含量、尾長、尾矩3個指標作為檢測DNA受到損傷的認定標準，結果處理6 d的16.00 mg/L濃度達到峰值，單細胞彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82。試驗結果為乙氧氟草醚的合理使用以及環境污染監測提供了科學依據。

關鍵詞：泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）；乙氧氟草醚；半數致死濃度；微核；單細胞凝膠電泳技術

中圖分類號：S966.4+91 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1522-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.029

Study on the Toxicity of Oxyfluorfen to Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua1， HUO Wei-ran1， LI Mo-yi2， DONG Hui1， XIA Xiao-pei1， DU Qi-yan1， CHANG Zhong-jie1

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2.The Affiliated High School of Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： In order to estimate the herbicide toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms， regarding the Misgurnus anguillicaudatus Cantor as the experimental object， we adapted the acute test， micronucleus test， single cell gelelectrophoresis to test its toxicity on M. anguillicaudatus. The results showed that， the half lethal concentration（LC50） of oxyfluorfen on the 24， 48， 72， 96 h were 36.66， 32.86， 28.92， 27.39 mg/L； respectively； the safe concentration（SC） was 7.92 mg/L. The micronucleus rate and nuclear anomalies in each experiment were increased with exposure time and concentration， which presents obvious time dose effect. The highest micronuclei and nuclear anomalies' rate reached the maximum which appeared in the highest concentration on 6 d. The results were permill 6.417‰±0.631‰， 65.417‰±5.080‰， respectively. In the comet assay， we chose the content of comet tail DNA， tail length and the olive tail moment（these three standards） to check the injure degree of DNA. The results showed that they reached to the peak value on 6 d and 16.00 mg/L. The peak value was 43.06%±2.54%， 268.00 pix±8.49 pix， 89.31±1.82， respectively. The studies showed scientific references for effective use of oxyfluorfen and environmental pollution monitoring.

Key words： Misgurnus anguillicaudatus Cantor； oxyfluorfen； LC50； micronucleus； single cell gel electrophoresis

現代生態農業養殖模式——嵌套養殖已經被越來越多的養殖戶青睞，而市面上常見的嵌套養殖模式當屬泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）-水稻模式。為了有效防治稻田病蟲害、雜草，提高水稻產量，施用農藥是重要的農藝措施之一，乙氧氟草醚便是常用的稻田除草劑。稻田中使用除草劑去除雜草的同時，大量散失的農藥也將流入到稻田水體中，這會給水體里的生物特別是稻田里面嵌套養殖的泥鰍帶來很大毒害，不僅給農戶造成經濟損失，而且這些有毒物質會通過食物鏈的富集、傳導作用轉移到人體內，從而引起人和動物的積累性中毒，對人類的健康構成了潛在的威脅[1]。因此應合理使用農藥，在有效防治病蟲草害的同時，降低農藥對農產品和環境的污染，達到可持續發展的目的。試驗以泥鰍為受試對象，通過急性毒性試驗、微核試驗、單細胞凝膠電泳技術檢測乙氧氟草醚對泥鰍遺傳物質DNA的損傷程度，評估了乙氧氟草醚對稻田中嵌套養殖泥鰍的遺傳毒性水平，以期為合理使用除草劑、高效養殖泥鰍、推廣現代生態農業養殖模式嵌套養殖及環境污染監測提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試泥鰍購自新鄉市海鴻農貿市場，選擇發育狀況良好、體重13～16 g、平均體長9～12 cm的健壯泥鰍350尾，試驗前用曝氣3 d的自來水馴養一周，馴養期間死亡率小于2%，挑選健康、體表無損的個體作為試驗材料。試驗前1 d停止喂食，進行饑餓處理，試驗期間不投喂。乙氧氟草醚除草劑購自新鄉市東海農資市場，上海惠光化學有限公司出品，有效成分含量23.5%。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 在前期預備試驗的基礎上，確定最大零致死濃度為乙氧氟草醚稀釋液20.00 mg/L、最小全致死濃度為45.00 mg/L。正式試驗在這2個濃度之間設置20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5個乙氧氟草醚稀釋液濃度梯度處理和1個空白對照處理，每處理投放10尾健康泥鰍，每24 h更換一次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。試驗開始后12 h連續觀察，并記錄其中毒癥狀；及時清理死亡個體，記錄泥鰍在24、48、72、96 h的死亡數量。采用改進寇氏法（Karber）[2，3]計算乙氧氟草醚對泥鰍的半數致死濃度（LC50），LC50的計算公式為：

LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），

式中，Xm為死亡處理最大劑量的對數，i為相鄰處理濃度的對數之差，∑p為各處理死亡率之和。安全濃度SC的計算公式為：

SC=LC50（24 h）×0.3/[（LC50（24 h）/LC50（48 h）]3。

1.2.2 微核試驗 在急性試驗毒性的基礎上，于安全濃度和最大零致死濃度之間，設置5個乙氧氟草醚濃度處理，分別是0.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L，每處理均隨機投放20尾健康泥鰍，每24 h更換一次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。分別設置2、4、6 d 3個時間段，試驗步驟參照文獻[4]的方法完成。微核試驗處理的數據有：

核異常率=（異常核的細胞數/總細胞數）× 1 000‰，

微核率=（雙核的細胞數/總細胞數）×1 000‰。

1.2.3 單細胞凝膠電泳試驗 單細胞（血細胞）懸浮液的制備步驟參照文獻[5]的方法。泥鰍的單細胞凝膠電泳試驗分別設置2、4、6 d 3個時間段處理，以試驗開始時間0為對照，各個時間段處理都設置4個乙氧氟草醚濃度，分別是8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L；運用CASP彗星圖像分析軟件及統計軟件SPSS 11.0對各處理的彗尾DNA所占含量（Tail DNA，%）、尾長（TL，pix）和Olive尾距（OTM）進行分析。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗

試驗觀察發現，不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍活動有相對明顯的影響。低劑量處理中，泥鰍基本上沒出現明顯的生理反應；但在高劑量處理中，泥鰍不斷地快速游動，有狂游躍出水面的現象，最終逐漸失去游動能力、翻白肚直至死亡；不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的急性毒性試驗結果見表1。由表1可知，乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的24、48、72、96 h的 LC50分別為36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，SC為7.92 mg/L。

2.2 微核試驗

不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的微核試驗結果見表2。從表2可見，對照處理的泥鰍紅細胞自發微核和核異常細胞率在各處理時間上無明顯個體差異；而乙氧氟草醚處理的濃度越高，在處理時間一定的條件下，泥鰍的血細胞微核率和核異常率越高，各乙氧氟草醚稀釋液濃度處理都與對照之間存在極顯著差異（P<0.01）；并在20.00 mg/L的濃度下達到最高，處理6 d的微核率達到6.417‰±0.631‰，核異常率達到65.417‰±5.080‰。并且處理6 d的微核率和核異常率都比處理4 d與2 d的高。

2.3 單細胞凝膠電泳試驗

乙氧氟草醚稀釋液處理泥鰍后單細胞（血細胞）凝膠電泳比較情況見圖1。由圖1可見，對照的細胞核呈圓球形，頭部DNA集中；而在乙氧氟草醚稀釋液各處理中，細胞核呈現彗星樣，具有長度不同的慧尾，而且隨著濃度的增加，彗星頭部逐漸縮小，變得發散。利用彗星圖像分析軟件CASP及統計軟件SPSS 11.0測量與統計分析單細胞凝膠電泳情況，結果見表3。從表3可見，在處理2 d的單細胞中，泥鰍的彗尾DNA含量、尾矩、尾長隨著乙氧氟草醚濃度的增加，各數值都明顯增大，與對照都存在極顯著差異（P<0.01）或顯著差異（P<0.05），并在20.00 mg/L時達到峰值，此時單細胞彗尾DNA含量為28.17%±1.32%，尾長為165.00 pix±4.24 pix，尾矩為31.34±5.25，說明在處理時間為2 d的情況下，乙氧氟草醚稀釋液隨著濃度的增加，對泥鰍細胞的DNA損傷也越嚴重。在處理4 d的單細胞中，試驗結果所呈現的趨勢大致與處理2 d相同，且3項數值在20.00 mg/L中同樣也達到峰值，單細胞彗尾DNA含量為29.99%±4.06%，尾長為219.00 pix±25.46 pix，尾矩為51.34±8.26，與對照相比都存在極顯著差異（P<0.01），并且較處理2 d而言，3項數值都有了大幅度提升，說明乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍細胞DNA的損傷有時間劑量效應。而在6 d的各處理中，3項數值在16.00 mg/L濃度中達到峰值，彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82。

3 討論

3.1 乙氧氟草醚的毒性分類

急性毒性試驗結果顯示，低濃度處理24 h和48 h的泥鰍死亡率并沒有明顯的變化；高濃度處理中隨著乙氧氟草醚濃度的不斷升高，泥鰍的死亡率明顯上升，且隨著染毒時間的增加，泥鰍的死亡率均呈上升態勢，說明乙氧氟草醚對泥鰍毒性存在時間-劑量效應。2009年新版的《國際海運危險貨物規則》中將化學物質對魚類的毒性分為3個等級[6]，其中96 h的LC50大于10.00 mg/L時屬于低毒。本試驗中乙氧氟草醚對泥鰍的96 h的LC50為27.37 mg/L，大于10.00 mg/L，由此說明除草劑乙氧氟草醚對泥鰍屬于低毒。

3.2 乙氧氟草醚對泥鰍單細胞DNA的損傷程度

除草劑中的致變物質能使泥鰍部分單細胞（血細胞）染色體發生斷裂或破壞其紡錘體，使之在有絲分裂過程中染色體斷片殘留于間期胞漿中形成微核；微核細胞率的高低可反映細胞染色體受損傷的程度[7]。試驗中，泥鰍單細胞的微核率和核異常率均隨著乙氧氟草醚濃度的升高和時間的延長而增加。高濃度處理的泥鰍單細胞微核率和核異常率明顯要比低濃度處理的高。這可能是由于處理濃度過高后，使泥鰍單細胞自身修復機制失效，不能夠進行有效的自我修復，導致單細胞的核異常率和微核率提高造成的。

單細胞凝膠電泳試驗與經典的染色體畸變、微核相比，不僅可以研究低劑量下的生物效應，也可用于研究高劑量下的生物效應；既可以用于活細胞DNA的檢測，也能用于死亡細胞DNA的分析。因此單細胞凝膠電泳試驗非常適用于評價受試對象的遺傳毒性。試驗中，處理與對照相比，彗尾DNA含量、尾長、尾矩3個指標都隨著乙氧氟草醚濃度的升高以及處理時間的延長而有明顯的上升。當處理時間為6 d、乙氧氟草醚處理濃度為16.00 mg/L時，彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82，這3項數值均達到最大；而在之后的處理（6 d、20.00 mg/L）中3項數值都有明顯的下降，可能的原因是與DNA自身的修復機制有關，DNA在受到嚴重損傷時，會啟動SOS修復機制，使DNA的損傷程度減弱，導致拖尾出現不明顯現象。單細胞凝膠電泳試驗表明，乙氧氟草醚濃度越大，處理時間越長，對泥鰍DNA的損傷就越嚴重。

綜上所述，試驗證實了乙氧氟草醚對泥鰍單細胞的遺傳物質具有一定的毒性效應，為人們更好、更安全地使用此類除草劑提供了依據，值得養殖戶借鑒。并且合理使用農藥是嵌套養殖技術發展的關鍵，這對于農業生產安全和環境保護及其他相關領域都具有重要意義。

參考文獻：

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