大竹蟶源多肽與鈣螯合物的制備工藝及生物活性研究

王夢婭++陳媛媛++錢文舉++胡沁瑩++周宇++王夢璠++韓曜平

摘要：以大竹蟶肉蛋白和氯化鈣為原料，復合酶解法制備大竹蟶源多肽螯合鈣，考察螯合溫度、時間、大竹蟶源多肽與鈣離子的質量比和pH對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。根據響應面分析試驗結果，在溫度50 ℃，時間40 min，質量比1∶2，pH7.0條件下，螯合率為32.73%，螯合物中鈣含量為41.89%。傅里葉變換紅外光譜掃描檢測結果表明，竹蟶源多肽與鈣離子形成了螯合物，以硫代巴比妥酸法和抑菌圈試驗分別驗證此螯合物具有抗氧化活性和抑菌活性。

關鍵詞：大竹蟶；多肽鈣螯合物；制備工藝；抗氧化活性；抑菌活性

中圖分類號：S986.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1530-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.031

The Bioactivity and Preparation Technology for Peptides-Ca2+ from Solen grandis Proteins

WANG Meng-ya，CHEN Yuan-yuan，QIAN Wen-ju，HU Qin-ying，ZHOU Yu，WANG Meng-fan，HAN Yao-ping

（ College of Biology and Food Science， Changshu Institute Technology， Changshu 215500， Jiangsu，China）

Abstract： The combination between Solen grandis polypeptides and calcium chloride was studied based on the preparation of Solen grandis polypeptides from compound enzyme. Under given conditions，calcium binding capacity and chelated calcium content were investigated as a function of reaction temperature，time，mass ratio between Solen grandis polypeptides and calcium chloride（P/C） and pH. On the basis of the results of response surface analysis，the four reaction parameters were optimized to be 50 ℃，40 min，a P/C ratio of 1∶2 and pH 7.0，yielding a calcium binding capacity of 32.73% and a chelated calcium content of 41.89%. The formation of ca-polypeptide chelate was confirmed by the FT-IR spectra. The result indicates that the calcium chelate with Solen grsndis polypeptides. TBA test and the experiments of anti-bacterium-circles show that the chelate products are characteristic of oxidation resistance and antibacterial activity.

Key words：Solen grandis；peptides-Ca2+；preparation technology；antioxidant activity；antibacterial activity

鈣離子是機體內各項生命活動都不可缺少的一種物質。它對于維持生物細胞膜兩側的生物電位，維持正常的神經傳導功能，維持正常的肌肉伸縮及舒張功能以及神經肌肉傳導功能具有非常重要的作用，而且一些激素的作用機制也均需鈣離子表現出來，如作為凝血因子參與凝血過程；參與肌肉包括骨骼肌和平滑肌的收縮過程；參與神經遞質的合成與釋放，激素的合成與分泌過程；骨骼的形成等[1-3]。由于中國的膳食結構以植食性為主，難以攝入足夠的易被人體吸收的鈣，而含鈣量較多的奶和奶制品的攝入量較少，致使中國人普遍缺鈣，是全球居民缺鈣的首要國家[4]。而鈣離子與多肽螯合形成有機肽后，能夠借助多肽在體內的吸收機制提高其吸收率[5]。金屬鈣離子與蟶子多肽形成的螯合物具有口感好、易吸收等特點，并且其他方面的生物活性如抗氧化性和抗菌活性也得到了增強，同時提高了鈣離子和蟶子的營養價值。蟶子肉口味鮮美，營養豐富，俗稱“海里的人參”，“小人仙”，一直是餐桌上的常客，而且蟶子養殖具有生長快、生長周期短、易管理、產量高、成本低、效益好、見效快等特點，總之價格便宜，是一種大眾化的海產食品，可以作為很好的多肽來源[6]。

本研究以江蘇常熟常見的大竹蟶為原料，采用酶法[7]水解制備得到蟶子肉蛋白水解物，將此水解物與鈣離子螯合在不同的條件下進行螯合并研究其螯合物的抑菌活性和抗氧化活性，以期獲得最佳的螯合工藝和具有高抑菌活性和高抗氧化活性的金屬離子多肽螯合物，為具有抑菌活性和抗氧化活性的金屬離子多肽螯合物的研究與開發以及為補鈣的保健品研究與開發提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

竹蟶，江蘇常熟農貿市場；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，常熟理工學院生物與食品工程學院微生物實驗室；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，上海奧宇生物科技有限公司；亞油酸標品、α-生育酚標品、2-硫代巴比妥酸標品，Sigma公司；諾氟沙星藥品，上海浩然生物技術有限公司。AKTA蛋白純化系統：醋酸，無水乙醇，氯化鈣，乙二胺四乙酸二鈉，鉻黑T，氨水-氯化銨緩沖液。LB固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

臺式高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；雷磁牌臺式pH計（pHSJ-4A），上海儀電科學儀器股份有限公司；恒溫培養搖床，上海申賢恒溫設備廠；傅里葉變換紅外光譜儀（NICOLET380型），美國Thermo公司；超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；紫外分光光度計；冷凍干燥機；絞肉機；恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 試驗設計

1.2.1 蟶子多肽的制備 將蟶子去殼、去雜物，洗凈蟶子的肉蛋白，絞肉機攪碎，加0.5倍的水，調pH至6.0左右，以質量比100∶1分別加入木瓜蛋白酶和風味蛋白酶，在50 ℃下，放入恒溫加熱磁力攪拌器中酶解5 h，酶解后，放入離心管中5 000 r/min離心10 min，去沉淀取上清，漏斗過濾，將濾液倒入適量大小的培養皿中（厚度1 cm左右），保鮮膜封住，放入冰箱冷凍成塊，膜上戳小孔，放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，得到凍干粉。

1.2.2 蟶子多肽與鈣螯合物的制備 按一定的質量比稱取蟶子多肽凍干粉和氯化鈣，加入適量的蒸餾水，調節pH、溫度，在恒溫振蕩培養箱中進行一定時間的螯合反應，螯合結束后，向螯合溶液中加入無水乙醇進行離心，去上清取沉淀，將沉淀放入真空冷凍干燥機中干燥12 h，得到凍干粉。

1.2.3 單因素試驗 ①螯合溫度對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取5份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，調節pH至6.5，分別在30、40、50、60、70 ℃下放入恒溫振蕩培養箱中進行螯合反應40 min。②螯合時間對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取4份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，調節pH至6.5，放入50 ℃恒溫振蕩培養箱中分別進行螯合反應30、40、50、60 min。③螯合pH對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取9份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入277.5 mg的氯化鈣，用20 mL的蒸餾水溶解，分別調節pH為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，放入50 ℃恒溫振蕩培養箱中進行螯合反應40 min。④多肽與鈣離子的質量比對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。稱取7份200 mg的蟶子多肽粉末，分別加入50、40、66、67、100、200、400、800 mg的氯化鈣，即分別以質量比4∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，用20 mL蒸餾水溶解，調節pH至6.5，溫度50 ℃，放入恒溫振蕩培養箱中進行螯合反應40 min。

1.2.4 螯合物中鈣含量和螯合率的測定 按照“1.2.2”中的螯合反應步驟，螯合結束后，取5 mL螯合溶液加入80%乙醇溶液45 mL離心去沉淀取上清，取10 mL上清液放入錐形瓶中，氨水-氯化銨緩沖液調pH至12左右，加鉻黑T溶液，用EDTA二鈉溶液滴定，記錄每個錐形瓶所耗EDTA二鈉溶液體積數，取平均值，按照下列公式進行計算：

游離鈣離子質量=CEDTA×滴定體積×40×螯合溶液稀釋倍數；

螯合物中鈣含量=

■×100%

螯合率=■×100%

1.2.5 響應面分析確定最佳螯合工藝 利用Box-Behnken設計方法，4因素3水平，共29組設計配方進行螯合及滴定試驗，之后進行響應面分析，確定最佳螯合工藝（表1）。

1.2.6 檢測竹蟶多肽螯合鈣離子后的變化 將蟶子多肽鈣螯合物通過凝膠柱，分離純化后的螯合物冷凍干燥使成凍干粉，然后進行傅里葉變換紅外光譜檢測，與多肽進行比較氨基（3 400 cm-1）和羧基 （1 700 cm-1）的變化。

1.2.7 分離純化多肽螯合物 利用AKTA蛋白純化系統，將竹蟶多肽鈣螯合物進行分離純化，之后收集目標峰值對應的溶液即純化后的螯合物溶液冷凍干燥，得到凍干粉，備用。

1.2.8 抗氧化活性檢測 采用硫代巴比妥酸法[8]測定螯合物的抗氧化活性，α-生育酚作為標準品比較螯合物的抗氧化活性。

1.2.9 抑菌活性檢測 選用大腸桿菌（革蘭氏陰性）和枯草桿菌（革蘭氏陽性）兩種菌做濾紙片[9]抑菌圈試驗，比較抑菌圈的有無和大小，檢測螯合物的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

1）螯合溫度對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖1可知，螯合溫度對螯合物中的鈣含量影響不大，而螯合溫度50 ℃時有較好的螯合率，所以選取50 ℃為最佳的螯合溫度。

2）螯合時間對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖2可知，螯合時間對螯合物中鈣含量的影響不大，在螯合40 min后有較好的螯合率，所以選取40 min為最佳的螯合時間。

3）螯合pH對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖3可知，pH在3.0～7.5時螯合物中鈣含量變化很小，pH在7.5～9.0時螯合物中鈣含量一直在升高；而pH在3.0～7.5時螯合率變化較明顯，尤其pH為7時螯合率最高，而pH為7.5時螯合率略微下降，之后便一直上升。當pH為7.5之后螯合物中鈣含量和螯合率一直都呈較大的上升趨勢，根據試驗過程，推測原因是在螯合前加入的氫氧化鈉與鈣離子結合，溶液中的游離鈣離子量減少，導致螯合率和螯合物中鈣含量同時迅速升高。所以選擇pH為7。

4）多肽與鈣離子的質量比對螯合率和螯合物中鈣含量的影響。由圖4可知，質量比對螯合率的影響不大；在質量比1∶1之前，隨著質量比的變大，螯合物中鈣含量的變化不大，在1∶1處有一個較大的提高，在1∶1之后，螯合物中鈣含量提升較快。作為最佳的制備工藝，考慮到材料的利用率，在質量比0.5和0.25時，雖然螯合物鈣含量相對較高，但根據試驗情況，試驗中氯化鈣的浪費情況較嚴重，利用率不高，而且還需要對螯合產品中多余氯化鈣進行分離處理，所以選取1∶2作為最佳的質量比。

2.2 響應面分析法優化試驗結果

根據以上單因素試驗結果確定對多肽與鈣螯合反應影響較明顯的4個因素的較好水平，由于螯合物中鈣含量變化隨著反應條件的改變不如螯合率變化明顯，故以螯合率作為判定最佳反應條件的響應值進行響應面優化試驗[10]（表2）。

利用Design expert 9.0.6軟件對表1數據進行分析，得到以螯合率為響應值的線性擬合方程：螯合率=-644.898 75-15.254 44A+1.832 92B+2.344 5C+169.296 67D+0.033 333AB+0.053 333AC+1.02AD-0.008 75BC-0.06BD-0.195CD-1.444 44A2-0.010 88B2 -0.000 721 25C2-11.4D2。式中，A為質量比；B為時間；C為溫度；D為pH。且通過計算得蟶子多肽與鈣螯合反應的最佳條件是質量比1∶2，溫度49.98 ℃，時間39.74 min，pH 6.98，預測螯合率32.73%。按照此條件，重復3次取平均值，實際螯合率為32.33%，說明預測值與實際結果擬合性良好，響應面的優化方案可以使用，較為可靠。表3為模型顯著性分析，由表3可知A、D及AB較顯著。

2.3 多肽螯合鈣離子后的變化結果

由圖5可知，螯合物和蟶子多肽的特征峰位置相同，而每個特征峰對應的基團含量相差較大。在 3 400 cm-1附近多肽和螯合物都出現了強而寬的吸收峰，應該是-COOH中的-OH與N-H的伸縮帶重疊，是因為多肽中含有大量的-COOH和-NH2，螯合物中-OH帶較多肽向低波段移動了一些，一級螯合物中-OH吸收峰面積遠小于多肽中的峰面積，由于多肽在變成螯合物后，溶解度大大降低，表明多肽中的-OH參與螯合環的構成，-NH2也可能以提供孤電子對的方式參與螯合環的形成；在1 636 cm-1附近的吸收峰來自-C=O的伸縮振動，螯合物中-C=O帶較多肽向低波段稍稍移動了一些，螯合物和多肽的吸收峰面積比較后也減少了，說明-C=O也參與了螯合環的構成；1 402 cm-1附近的吸收峰來自酰胺鍵中的-C-N，同樣也可能參與了螯合環的形成。綜上所述，蟶子多肽和鈣離子已形成螯合物。

2.4 螯合物的分離純化

由圖6可知，為蟶子多肽與鈣螯合物經過AKTA蛋白分離純化系統后的曲線。活性檢測表明，多肽螯合物主要集中在最高峰值處。

2.5 抗氧化性檢測結果

通過硫代巴比妥酸法檢測亞油酸氧化量，檢測紅色素在535 nm處的吸光度，同α-生育酚的抗氧化性對照比較，根據公式抑制率=（M-N）/（M-W）×100%，（M表示加入50 μL純化水+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度，N表示加入50 mg多肽+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度，W表示加入50 μL α-生育酚+0.2 mL亞油酸混合液的吸光度），計算試驗所得數據，可得出蟶子多肽鈣螯合物的抗氧化活性相當于α-生育酚的71.08%。

2.6 抑菌活性檢測結果

通過濾紙片抑菌圈試驗，得到蟶子多肽螯合物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑菌效果。

3 結論

考慮到工藝簡化，提高資源利用率，根據響應面分析結果得到最佳的螯合工藝為蟶子多肽與鈣離子的質量比為1∶2，溫度49.98 ℃，時間39.74 min，pH 6.98。根據實際情況，確定最佳的大竹蟶多肽與鈣離子的最佳螯合條件為蟶子多肽與鈣離子的質量比為1∶2，溫度50 ℃，時間40 min，pH 7.0。

螯合后的產物經過分離純化，傅里葉變換紅外光譜檢測說明大竹蟶多肽和鈣離子進行了螯合反應，硫代巴比妥酸法試驗表明其具有較好的抗氧化性，抑菌圈試驗表明此螯合物也具有抗菌活性，所以有望作為一種良好的保健品。

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