兔骨髓基質干細胞的培養、鑒定及標記的實驗研究

鄧辰紅　王飛　王文蘭　朱華

【摘要】 目的 對兔骨髓基質干細胞的培養方法、鑒定及標記技術進行初步研究。方法 采用貼壁法培養幼年兔骨髓細胞， 經反復傳代細胞逐漸純化， 以流式細胞術檢測細胞表面抗原。以5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）標記骨髓基質干細胞， 將骨髓基質干細胞注入兔腦內， 2周后取腦作石蠟切片， 進行免疫熒光染色。結果 通過貼壁法培養幼年兔骨髓細胞可獲得較純化的細胞， 并能在體外長期培養。CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。提示CD31、CD34、CD45 的結果為呈陰性， CD44、CD71、 CD90的結果為陽性， BrdU能夠摻DNA合成期的骨髓基質干細胞。結論 貼壁法可獲得高純度的骨髓基質干細胞， BrdU可作為骨髓基質干細胞體內示蹤的理想標記物。

【關鍵詞】 骨髓基質干細胞；CD分子；5-溴脫氧尿嘧啶核苷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.32.091

【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.

【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine

骨髓基質細胞是一種不具有造血功能的細胞， 由于該細胞容易取材， 并且可以體外擴增以及多向分化等優點， 逐漸成為受到廣泛研究[1-4]。本文作者主要對兔骨髓基質干細胞的培養、鑒定以及標記作簡單探究。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑 ①材料：本文選擇的研究對象為幼兔， 主要來源于內蒙古實驗動物中心。②試劑：主要有Gibco生產的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生產的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生產的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生產的經異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD45和CDmAb， 剩余試劑則由我國生產。

1. 2 方法

1. 2. 1 原代培養骨髓基質干細胞 將幼兔采用脫頸的方式將其處死， 在充分消毒以后取出兩側的股骨， 中斷股骨并反復用肝素生理鹽水進行沖洗， 主要是將骨髓細胞沖出， 將沖出的骨髓細胞加入至容量為200 ml的LG-DMEM培養液中， 將其在室溫為37℃環境中進行培養， 培養2 d后更換一半培養液， 以后每隔1～2 d在更換一半的培養液， 等到7～8 d后便可以實現1次傳代[5-8]。

1. 2. 2 骨髓基質干細胞鑒定 將經上述步驟培養出的第六代并且已純化的骨髓基質干細胞消化， 在計數之后將其倒入離心管內， 使用磷酸鹽緩沖液（PBS） 0.01 mol/L洗滌1次， 離心的時間控制在5 min， 離心的轉速為800 r/min， 離心成功后， 再將其加入至200 μl的PBS重懸細胞中， 加入FITC分別標記出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室溫為37℃以及無關的環境下反應1 h， 待反應結果后， 在使用聚甲醛40 g/L進行固定， 最后檢測流式細胞數[9-12]。

1. 2. 3 BrdU標記骨髓基質干細胞的體外研究 選擇處于對數生長期的骨髓基質干細胞開展細胞爬片， 等到細胞生長到一半時加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗滌， 運用多聚甲醛固定好后開展免疫組化和免疫熒光染色， 最后封面進行觀察。

1. 2. 4 BrdU標記骨髓基質干細胞的體內研究 在幼兔顱內注射經過BrdU標記的骨髓基質干細胞， 3周后脫頸處死并取出腦， 在穿刺點附近開展石蠟切片后開展免疫熒光染色。具體步驟為：首先， 常規脫蠟至水， 分別用30 ml/L 過氧化氫（H2O2）、2 mol/L 氯化氫（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L

牛血清白蛋白室溫封閉約10 min， 加入2 mol/L HCl， 室溫下孵育30 min， 再將4 g/L的胃蛋白酶室溫孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在濕盒中孵育過夜， 溫度為4℃；然后將TRITC標記抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室溫下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸餾水洗滌， 封片觀察[13-16]。選擇同一個組織切片隨機選擇6個不同的視野分別計算陽性率， BrdU標記陽性率=6個不同的視野分別計算陽性率/6個視野細胞總數×100%。

2 結果

2. 1 骨髓基質干細胞培養結果 在對小兔骨髓基質干細胞培養的初期， 能夠看見很多懸浮的細胞， 再培養2 d后發現了一些形狀為紡錘形的貼壁細胞呈分散狀態， 在經過數次更換培養液后， 貼壁上的細胞數量不斷減少直至消失， 4 d后可以發現貼壁的紡錘細胞數量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細胞， 但是在經過數次傳代培養以后， 混雜細胞逐漸純化， 細胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。

2. 2 骨髓基質干細胞的鑒定 經鑒定發現， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。

2. 3 骨髓基質干細胞體內外標記 將小兔的骨髓基質干細胞免疫組化以后， 結果可以觀察到呈棕色的陽性細胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標本， 經計算， BrdU標記的細胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發現細胞核染色顯著， 但若將BrdU標記骨髓基質干細胞注入體內， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發現密集的細胞。

3 討論

骨髓基質干細胞屬于一類具有多向分化潛能的干細胞， 當理化環境不同和受到細胞因素誘導時， 可以進一步向成軟骨、成骨、脂肪以及纖維細胞系等[17-19]進行多方向性擴增和分離， 并且骨髓基質干細胞還容易被外源基因感染， 因此當前成為基因治療和組織工程的較理想的靶細胞。因此如何獲取并純化骨髓基質干細胞已經成為醫學界研究的重大課題。分離和純化骨髓基質干細胞的基本原則為細胞的粘附性。當前， 從骨髓中獲得基質干細胞常采用兩種途徑[20]：①為梯度離心法獲得干細胞；②為全骨髓細胞培養。

本研究通過貼壁法培養幼年兔骨髓細胞可獲得較純化的細胞， 并能在體外長期培養， 結果提示：骨髓基質干細胞培養在對小兔骨髓基質干細胞培養的初期， 能夠看見很多懸浮的細胞， 再培養2 d后發現了一些形狀為紡錘形的貼壁細胞呈分散狀態， 在經過數次更換培養液后， 貼壁上的細胞數量不斷減少直至消失， 4 d后可以發現貼壁的紡錘細胞數量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細胞， 但是在經過數次傳代培養以后， 混雜細胞逐漸純化， 細胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。骨髓基質干細胞的鑒定：經鑒定發現， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。骨髓基質干細胞體內外標記：將小兔的骨髓基質干細胞免疫組化以后， 結果可以觀察到呈棕色的陽性細胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標本， 經計算， BrdU標記的細胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發現細胞核染色顯著， 但若將BrdU標記骨髓基質干細胞注入體內， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發現了密集的細胞。

綜上所述， CD31、CD34、CD45 的結果為呈陰性， CD44、CD71、 CD90的結果為陽性。BrdU可摻DNA合成期的骨髓基質干細胞， 由此得出貼壁法可獲得高純度的骨髓基質干細胞， BrdU可作為骨髓基質干細胞體內示蹤的理想標記物， 依此可以作為檢測骨髓基質干細胞的一個依據。

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[收稿日期：2016-10-22]