Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)

王月秋++李珊珊++曾紅++張景海

【摘 要】大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素53位均為天冬氨酸，但目前尚無這個殘基在毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的報道。本研究采用突變分析的方法考察Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9鎮(zhèn)痛活性的關(guān)聯(lián)，構(gòu)建突變體D53A，D53E，D53N和D53K，小鼠扭體法測定重組BmK9及其突變體的鎮(zhèn)痛活性。結(jié)果顯示除D53E這一保守取代外，其余三個突變都導(dǎo)致了鎮(zhèn)痛活性的顯著降低。目前的研究結(jié)果提示，Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

【關(guān)鍵詞】Asp53 BmK9 鎮(zhèn)痛活性 定點突變 結(jié)構(gòu)功能關(guān)系

東亞鉗蝎（BmK）作為傳統(tǒng)中藥用于治療多種慢性疼痛已有幾千年的歷史，迄今為止，發(fā)現(xiàn)了十余種多肽類的東亞鉗蝎毒素具有鎮(zhèn)痛活性[1-5]。它們都是60-76個氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽，屬于蝎長鏈神經(jīng)毒素，具有共同的結(jié)構(gòu)核心[6]。這些毒素結(jié)構(gòu)的相似性是否意味著它們有著共同的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)位點值得關(guān)注，研究者通過基因突變分析的方法對幾個毒素的結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛活性關(guān)系進行了考察，揭示了幾個位點與鎮(zhèn)痛活性的關(guān)聯(lián)[5，7-11]。最近，鄧理等報道了兩個保守的酪氨酸（Tyr5 和Tyr42） 在BmK AGP-SYPU1[12]鎮(zhèn)痛活性中的作用，但有關(guān)東亞鉗蝎毒素鎮(zhèn)痛活性相關(guān)位點的信息還非常有限。

BmK9是從東亞鉗蝎蝎毒獲得的65個氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈鎮(zhèn)痛活性肽[5]，編碼BmK9前體（GenBank ID： DQ981785）的全長cDNA已被克隆。BmK9的53位是一個天冬氨酸，在大多數(shù)的東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛肽中該位點都被天冬氨酸占據(jù)（圖1所示），但是目前還沒有Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的研究。本研究對BmK9在53位進行定點突變以考察53位天冬氨酸在鎮(zhèn)痛活性中的作用。基于獲得的實驗結(jié)果，討論了Asp53在BmK9鎮(zhèn)痛活性中的重要性。

通過ClustalW2進行比對[13]（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。在序列中插入空隙（用“-”表示）以獲得最大相似性，氨基酸殘基的編號及序列一致性以BmK9為依據(jù)，53位殘基用箭頭指示。基因庫序列號如下：BmK9 （DQ981785），BmK AngM1 （AF164203），BmK AGAP（AF464898），BmK AGP-SYPU1 （GU726488），BmK AGP-SYPU2 （GU726489），BmK dITAP3 （AF064821）[14]，BmK IT2 （UniProtKB/Swiss-Prot： P68727）[15]，BmK IT-AP （AF156171），BmK AS （AF079060）和BmK AS1 （AF079061）[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pSYPU-BmK9和pSYPU由實驗室構(gòu)建，用于表達的宿主菌BL21（λDE3）購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶，Taq DNA聚合酶和引物來自南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；金屬離子螯合親和層析及陽離子交換層析介質(zhì)購于瑞典Pharmacia公司；SPF級昆明種小白鼠由北京華富康生物科學(xué)公司（NO： SCXK-[京]2009-004，北京，中國）提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建

根據(jù)BmK9的序列設(shè)計4個下游引物：D53A，5′-CGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT AGC GGG CA-3′； D53N，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT ATT GGG CA-3′；D53E，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT TTC GGG CA-3′；D53K，5′ -CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT CTT GGG CA-3′。以質(zhì)粒pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進行PCR擴增。產(chǎn)物酶切后克隆至載體pSYPU，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽性克隆菌落PCR驗證后測序。

1.2.2 誘導(dǎo)表達及分離純化

將含有重組質(zhì)粒pSYPU-BmK9，pSYPU-BmK9/D53A，pSYPU-BmK9/D53N pSYPU-BmK9/D53E 和 pSYPU-BmK9/D53K 的大腸桿菌接種于含 50 mg·L-1 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，異丙基-β-D -硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)目的蛋白表達。收集菌體超聲破碎后離心，上清液經(jīng)金屬離子螯合的親和層析柱（Chelating Sepharose Fast Flow， 1.0 cm×6.5 cm）進行初步純化，以pH值3.0的0.1 mol·L-1 PBS洗脫目的蛋白。收集目的蛋白，經(jīng)SP Sepharose Fast Flow柱（1.0 cm×20 cm）進一步純化，用0～1.0 mol·L-1NaCl水溶液（含50 mmol·L-1PBS，pH值6.6）梯度洗脫目的蛋白。SDS-PAGE 分析重組蛋白純度，考馬斯亮藍R-250 染色[8]。

1.2.3 鎮(zhèn)痛活性

小鼠醋酸扭體法考察鎮(zhèn)痛活性，用生理鹽水配制合適濃度的重組蛋白溶液進行活性檢測。取18～20g昆明種 SPF 級小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組10只，按 0.5mg/kg 的劑量尾靜脈給藥，20min 后按 0.2ml/20g 體重腹腔注射 0.6% 醋酸引起內(nèi)臟痛，5min 后記錄小鼠 10min 內(nèi)的扭體次數(shù)。以重組BmK9 為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應(yīng)抑制率。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物克隆至表達載體pSYPU，構(gòu)建成功的表達質(zhì)粒分別熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（λDE3）細胞，挑取重組子驗證。DNA序列測定顯示 BmK9 及其突變體基因均正確克隆。

2.2 誘導(dǎo)表達及分離純化

IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白主要以可溶性形式表達。兩步層析法純化重組蛋白后，15%SDS-PAGE分析重組蛋白（以突變體D53A為例）的純度，結(jié)果見圖2所示，重組蛋白的純度基本達到電泳純。

泳道1，兩步層析純化的重組BmK9；泳道2，兩步層析純化的突變體D53A；泳道M，低分子量蛋白標準品

2.3 鎮(zhèn)痛活性

如表1所示，與生理鹽水組相比，重組BmK9及其突變體均呈現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛效果（p<0.05）。與重組BmK9相比，突變體D53A，D53N和D53K的鎮(zhèn)痛活性均顯著降低，而突變體D53E與重組BmK9的鎮(zhèn)痛活性無明顯差別。

3 討論

大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素的53位都是天冬氨酸，Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中的作用有待鑒定，而定點突變是闡明特定位點氨基酸殘基作用的一種有效途徑。用非極性的甲基（CH3）取代天然毒素的羧甲基（CH2COOH），突變體D53A的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降42%），提示Asp53與BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關(guān)鍵作用。極性不帶電荷的天冬酰胺取代天冬氨酸的突變D53N也導(dǎo)致鎮(zhèn)痛活性的顯著降低（下降50%），提示Asp53的側(cè)鏈羧基是通過凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮作用。同種電荷取代的突變體D53E的鎮(zhèn)痛活性與BmK9的鎮(zhèn)痛活性幾乎相同，而相反電荷取代的突變體D53K的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降34%），則進一步證實了53位的側(cè)鏈負電荷對毒素鎮(zhèn)痛活性的重要性。

本研究結(jié)果提示東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的Asp53通過其側(cè)鏈羧基的凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這一結(jié)果為蝎毒素結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛活性關(guān)系研究提供了進一步的信息。

參考文獻：

[1]Rajendra， W.， Armugam， A. and Jeyaseelan， K. Toxins in anti-nociception and anti-inflammation.Toxicon，2004（44）：1-17.

[2]Cao， Z.Y.， Mi， Z.M.， Cheng， G.F.， Shen， W.Q.， Xiao， X.， Liu， X.M.， Liang， X.T. and Yu，D.Q.（2004） Purification and characterization of a new peptide with analgesic effect from the scorpion Buthus martensi Karch. J Pept Res.64，33-41.

[3]Wang， Y.， Wang， L.， Cui， Y.， Song， Y. B.， Liu， Y. F.， Zhang， R.， Wu， C. F. and Zhang， J. H.（2011） Purification， characterization and functional expression of a new peptide with an analgesic effect from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch （BmKAGP-SYPU1）. Biomed. Chromatogr.25，801-807.

[4]Zhang， R.， Cui， Y.， Zhang， Xi.， Yang， Zhuo.， Zhao， Y.S.， Song， Y.B.， Wu， C. F. and Zhang， J. H. （2010） Soluble expression， purification and the role of C-terminal glycine residues in scorpion toxin BmK AGP-SYPU2.BMB Rep.43，801-806.

[5]Wang， Y.Q.， Hao， Z.H.， Shao， J.H.， Song， Y.B.， Li， C.L.， Li， C.， Zhao， Y.S.， Liu， Y.F.， Wei， T.T.， Wu， C.F. and Zhang， J.H. （2011） The role of Ser54 in the antinociceptive activity of BmK9， a neurotoxin from the scorpion Buthus martensii Karsch. Toxicon.58，527-532.

[6]Mouhat， S.， Jouirou， B.， Mosbah， A.， De Waard， M. and Sabatier， J.M. （2004） Diversity of folds in animal toxins acting on ion channels. Biochem. J. 378， 717-726.

[7]Xiong， Y.M.， Lan， Z.D.， Wang， M.， Liu， B.， Liu， X.Q.， Fei， H.， Xu， L.G.， Xia， Q.C.， Wang， C.G. Wang， D.C.， Chi， C.W. （1999） Molecular characterization of a new excitatory insect neurotoxin with an analgesic effect on mice from the scorpion Buthus martensi Karsch. Toxicon.37，1165-1180.

[8]Ma， R.， Cui， Y.， Zhou， Y.， Bao， Y. M.， Yang， W.Y.， Liu， Y. F.， Wu， C.F. and Zhang， J.H. （2010） Location of the analgesic domain in Scorpion toxin BmK AGAP by mutagenesis of disulfide bridges. Biochem. Biophy. Res. Commun. 394， 330-334.

[9]Cui， Y.， Guo， G.L.， Ma， L.， Hu， N.， Song， Y.B.， Liu， Y.F.， Wu， C.F. and Zhang， J.H. （2010） Structure and function relationship of toxin from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch （BmKAGAP）： gaining insight into related sites of analgesic activity. Peptides.31，995-1000.

[10]Cui， Y.， Song， Y.B.， Ma， L.， Liu， Y.F.， Li， G.D.， Wu， C.F. and Zhang， J.H. （2010） Site-directed mutagenesis of the toxin from the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch （BmKAS）： Insight into sites related to analgesic activity. Arch Pharm Res. 33，1633-1639.

[11]Wang， Y.， Song， Y.B.， Yang， G.Z.， Cui， Y.， Zhao， Y.S.， Liu， Y.F.， Ma， Y.， Wu， C.F. and Zhang， J.H.（2012） Arginine residues in the C-terminal and their relationship with the analgesic activity of the toxin from the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch （BmK AGP-SYPU1. Appl Biochem Biotechnol. 168， 247-255.

[12]Deng， L.， Zhang， H.X.， Wang， Y.， Zhang， R.， Wen， X.， Song ，Y.B.， Zhao， Y.S.， Ma， L.， Wu， C.F. and Zhang， J.H. （2014） Site-directed mutagenesis of BmK AGP-SYPU1： the role of two conserved Tyr （Tyr5 and Tyr42） in analgesic activity. Protein J. 33，157-164.

[13]Larkin， M.A.， Blackshields， G.， Brown， N.P.， Chenna， R.， McGettigan， P.A.， McWilliam， H.， Valentin， F.， Wallace， I.M.， Wilm， A.， Lopez， R.， Thompson， J.D.， Gibson T.J. and Higgins， D.G. （2007） ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics. 23，2947-2948.

[14]Guan， R.J.， Wang， C.G.， Wang， M. and Wang， D.C. （2001） A depressant insect toxin with a novel analgesic effect from scorpion Buthus martensii Karsch. Biochim. Biophys. Acta.1549，9-18.

[15]Tan， Z.Y.， Xiao， H.， Mao， X.， Wang， C.Y.， Zhao， Z.Q. and Ji， Y.H. （2001） The inhibitory effects of BmK IT2， a scorpion neurotoxin on rat nociceptive flexion reflex and a possible mechanism for modulating voltage-gated Na+ channels. Neuropharmacology.40，352-357.

[16]Ji， Y.H.， Li， Y.J.， Zhang， J.W.， Song， B.L.， Yamaki， T.， Mochizuki， T.， Hoshino， M. and Yanaihara， N. （1999） Covalent structures of BmK AS and BmK AS-1， two novel bioactive polypeptides purified from Chinese scorpion Buthus martensi Karsch. Toxicon.37，519-536.