雪櫻子組織培養及植株再生體系的研究

杜澤宇 劉丹 宗憲春 李然紅 孫雪芳

摘要：以雪櫻子無菌苗葉片及莖段為外植體，研究了不同激素及不同濃度激素配比的培養基對雪櫻子愈傷組織的誘導、不定芽分化及其生根的影響。結果表明，愈傷組織誘導以及芽分化最適培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.2 mg/L，出愈率為87.5%，分化率為65.0%；生根最適培養基為MS+ IAA 0.2 mg/L。

關鍵詞：雪櫻子；愈傷組織；不定芽；生根

中圖分類號：R282.71；S567.219 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）09-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.09.009

Effects of Shading on Stomatal and Photosynthetic Characteristics of Spring Wheat Under Elevated Atmospheric CO2 Concentration

YU Xianfeng 1， 2， ZHANG Xucheng 1， 2， FAN Yanjie 1， 2， WANG Hongli 1， 2， HOU Huizhi 1， 2， MA Yifan 1， 2， ZHAO Jijun 3

（1. Institute of Dryland Farming，Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China； 2. Key Laboratory of High Water Utilization on Dryland of Gansu Province， Lanzhou Gansu 730070， China； 3. Gansu Agriculture Environment Protection Station， Lanzhou Gansu 730000，China）

Abstract：Effects of shading and elevated atmospheric CO2 concentration on leaf photosynthetic physiology are investigated using shading and elevated atmospheric CO2 concentration treatments. The result shows that compared with normal sunlight condition， shading treatments increased stomata length by 22.93% and 10.23%， decreased stomata width by 30.00% and 30.22%， decreased stomatal area by 17.99% and 18.11%， increased circumference by 16.80% and 6.85%， decreased stomata density by 6.61% and 23.78%， and decreased stomatal index by 5.99% and 14.23%， under normal and elevated atmospheric CO2 concentration， respectively. Compared with normal atmospheric CO2 concentration， elevated atmospheric CO2 concentration increased stomatal area by 1.91% and 1.95%， decreased stomata density by 14.33% under sunlight condition while increased by 5.00% with shading treatment. Compared with sunlight condition， shading decreased stomatal conductance by 56.11% and 53.21% and transpiration rate by 40.57% and 49.27% under normal and elevated CO2 concentration， respectively. However， the treatments have no effects on photosynthetic rate， which is probably due to the occurrence of “light adaptation” under elevated CO2 concentration. Compared with normal atmospheric CO2 concentration， elevated CO2 concentration decreased stomatal conductance of wheat. Leaf pore length and blades width of wheat are significantly correlated with the rate of photosynthesis.

Key words： Elevated atmospheric CO2 concentration； Stomatal characteristics； Photosynthetic characteristics

雪櫻子（Amaranthus caudatus L.）學名為尾穗莧，別名為老槍谷、仙人谷，為莧科莧屬一年生草本植物。雪櫻子原產于熱帶、亞熱帶地區，在我國各地均有栽培。作為一種藥食兩用植物，其營養價值高，在許多國家和地區都作為一種重要的農作物被大量種植。雪櫻子種子脂肪和蛋白質含量高，氨基酸成分均衡，其中賴氨酸和蛋氨酸含量更是比豆類和谷類高[1 - 2 ]。此外，雪櫻子還可作為常用中藥使用，全草入藥，具有健脾益血、解毒消腫止痛、生津止渴、補血強精的功效[3 - 4 ]。Plate等研究表明，血膽固醇過高的兔子在食用雪櫻子后，其低密度脂蛋白及總膽固醇均有不同程度的減少[5 ]。我國一些地方的地物志、藥物志已將雪櫻子作為常用中草藥收錄，它含有一種與人垂體激素十分相似的植物激素，可以促進精液的形成，有著良好的性保健作用[6 - 7 ]。目前國內外關于雪櫻子的研究很少，主要集中在研究其成分的提取和分析等方面，對其植物組織培養方面的研究尚處于起步階段，Bennici等[8 ]對不同變種的雪櫻子愈傷組織的形成及分化進行了研究，發現其分化再生具有品種特異性，且該體系培養周期長，再生頻率較低。我們以雪櫻子葉片及莖段為試驗材料，利用植物組織培養技術成功構建出其高效再生植株體系，以期為雪櫻子快速繁殖、性狀改良、轉基因技術育種以及種質資源的保存和利用提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雪櫻子種子購自山東省壽光市問天種業。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制及培養條件設定 以MS為基礎培養基，附加瓊脂3%、蔗糖0.8%，加入不同濃度激素組合（表1），調pH至5.8，分裝于100 mL組培瓶中，每處理重復4次，加膜封口，于高壓滅菌鍋中121 ℃下高壓滅菌20 min。滅菌后置于溫度25 ℃、光照強度為1 800 Lx的組培室中，光照16 h/d。

1.2.2 無菌苗培養 取顆粒飽滿的雪櫻子種子，于70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞浸泡5 min，用無菌水沖洗至無升汞殘留。用無菌濾紙吸干表面水分后接種于1/2MS培養基[9 ]，暗培養1 d后移到培養間進行光照培養，7 d后獲得生長健壯的無菌苗。

1.2.3 愈傷組織誘導和不定芽分化培養基的篩選

取生長健壯的無菌植株，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm、莖剪成0.5 cm長的莖段作為接種的外植體。將已剪好的外植體接種至不同激素配比的培養基上進行培養，激素組合選擇6-BA 1.0、2.0、3.0 mg/L與IAA 0.1、0.2、0.3 mg/L排列組合方式。每種培養基上接種外植體10塊，4次重復，15 d繼代1次；接種愈傷組織5塊，重復4次，同樣選擇上述方法培養，20 d后統計出愈率。出愈率= 有愈傷組織形成的外植體數/接種外植體數×100，30 d后觀察記錄芽分化情況，統計分化率。分化率=有芽形成的外植體數/接種的愈傷組織塊數×100。

1.2.4 生根培養基篩選 生根培養以MS為基礎培養基，附加IAA作為誘導激素，激素濃度選擇0.1、0.2、0.3 mg/L。將長3～4 cm的健壯芽剪下，使之成為單株無根苗，然后接種至不同生根培養基上，每種培養基接種10個芽，重復4次，20 d后觀察根生長狀況，統計生根率。生根率=有根形成的芽數/接種的芽數×100。

2 結果與分析

2.1 不同激素對雪櫻子外植體愈傷組織形成的影響

由表1可知，雪櫻子葉片外植體接種到不同激素組合的培養基中，其出愈率和出芽率差異明顯。5號培養基MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L的出愈率和出芽率最高；9號培養基MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L組合最低，出愈率為17.5%，僅為5號培養基的1/5，出芽率為0。并且在相同6-BA水平下，IAA 0.2 mg/L濃度時的出愈率和出芽率明顯高于其他2個IAA濃度水平，IAA濃度0.2 mg/L時的愈傷組織呈淡綠或綠白色，結構緊實，芽點清晰，生長速率高。相同IAA水平下，6-BA濃度1.0 mg/L時明顯低于2.0 mg/L時的出愈率、出芽率，此時愈傷組織呈白綠色，結構松散，芽點較少發白，生長速率低；而6-BA 濃度3.0 mg/L時的出愈率和出芽率顯著低于其他2個6-BA濃度水平，愈傷組織發黑或褐色，結構易散呈水漬狀顆粒，芽點干而脆，大多數是盲芽，生長速率無。上述結果表明，激素組合為MS+6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.2 mg/L時的出愈率和出芽率最優。

2.2 生根培養基的篩選

由表2可知，不定芽轉接至生根培養基后，IAA濃度為0.2 mg/L時根啟動最早，且不定根生成明顯，生根率高達98%，主根粗而壯，側根較多；而低濃度和高濃度的IAA均不利于雪櫻子生根，這與伍展紅等[10 ]的研究相似：低濃度和高濃度的IAA培養基其根系較短、主根細長，側根較少或完全無側根。

3 結論與討論

在植物組織培養技術中，植物生長調節劑的使用是必不可少的，6-BA是植物組織培養中常用的細胞分裂素，廣泛應用于各種植物再生體系的建立[11 ]。已有大量研究表明，IAA和6-BA結合使用會提高大部分植物外植體的再生頻率[12 ]，但由于所選用植物種類及品種的不同，其用法用量也有較大差別[13 - 15 ]。本研究表明，在MS培養基中附加不同6-BA和IAA的濃度配比，雪櫻子葉片和莖段外植體均能產生愈傷組織。愈傷組織誘導和芽分化可在同一種培養基上進行。雪櫻子外植體分化芽的能力取決于培養基中生長素和細胞分裂素的比例。本研究結果表明，雪櫻子的出愈率和分化率在2種激素的不同濃度組合間存在很大差異。MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L組合出愈率和出芽率最高，說明中濃度的6-BA和IAA有利于雪櫻子愈傷組織的形成和芽的分化。生根培養試驗也表明，中濃度的IAA生根率高且根系發達。本研究建立了雪櫻子的植物組織培養再生體系，可以將愈傷組織作為轉基因植物的轉化受體，進而再分化得到轉基因植株，為雪櫻子品種改良技術研究提供參考。

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