檸條錦雞兒獸3H基因克隆及功能分析

鄭晟 毛玉珊 張騰國 聶亭亭

摘要： 檸條錦雞兒為豆科灌木，對各種環境脅迫具有較強的適應能力，類黃酮是天然的抗氧化劑，花青素屬類黃酮化合物，逆境脅迫會影響植物體內花青素的合成，而黃烷酮3羥化酶 （F3H） 是花青素生物合成所必需的一種關鍵酶。該研究成功分離克隆了檸條錦雞兒的F3H基因，命名為CkF3H。CkF3H基因的開放閱讀框 （ORF） 為1 095 bp，編碼364個氨基酸，推測的蛋白質分子量為41.3 kDa，理論等電點為5.9。生物信息學分析發現，CkF3H基因序列與其它植物F3H有較高的一致性，推測CkF3H蛋白與其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色體步移法克隆得到CkF3H起始密碼子ATG上游468 bp的啟動子序列，PlantCARE軟件分析表明，該序列具有啟動子的基本元件CAATbox和TATAbox以及多種與逆境脅迫相關的順式調控元件。實時熒光定量PCR分析表明，CkF3H在檸條的根、莖和葉中均有表達，沒有組織特異性；CkF3H的表達受低溫、高鹽、干旱和高溫脅迫的誘導，并且在低溫脅迫下，CkF3H的表達還受到光周期的影響。綜上所述，研究結果表明CkF3H基因在檸條錦雞兒適應低溫、高鹽、干旱和高溫脅迫的過程中發揮作用。

關鍵詞： 檸條錦雞兒， CkF3H基因， 基因克隆， 表達分析， 非生物脅迫

中圖分類號： Q943.2

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06072311

Abstract： Caragana korshinskii is a kind of shrub belonging to the leguminosae category and it has characteristic of tolerance to stressful conditions. Flavonoids are natural antioxidants that include the groups of notable pigments such as anthocyanins. The adversity stress can influence the biosynthesis of anthocyanins in plants. Flavanone 3Hydroxylase （F3H） is a key enzyme needed for the biosynthesis of anthocyanins. In this study， we successfully isolated， cloned F3H gene from C. korshinskii. The full length cDNA of C. korshinskii F3H gene （designated as CkF3H） had an open reading frame （ORF） of 1 095 bp encoding 364 amino acids with a calculated molecular mass of 41.3 kDa as well as an isoelectric point of 5.9. Comparative and bioinformatical analyses revealed that the cloned CkF3H from C. korshinskii has high identity with F3H from other plant species. The deduced CkF3H protein showed similarities with other available plant F3H proteins. The promoter of CkF3H gene was isolated by chromosomal walking and 468 bp sequence was obtained by sequencing. PlantCARE analysis of this sequence showed that the peomoter contained some typical elements CAATbox and TATAbox and kinds of Cisacting elements involved in defence and stress responsiveness. RTPCR analysis revealed that CkF3H was expressed in roots， stems， and leaves with almost no tissue specificity. The transcript level of CkF3H was increased in response to cold， high salt， drought and high temperature stress. The gene expression of CkF3H was influenced by photoperiod in response to cold stresses. The results suggested that CkF3H played an important role during cold， high salt， drought and high temperature stress in C. korshinskii.

Key words： Caragana korshinskii， CkF3H gene， gene cloning， expression analysis， abiotic stress

類黃酮（又稱黃酮類物質）是一類廣泛分布于高等植物中的多酚類次生代謝產物，是存在于植物中的天然色素（Shirley， 1996）。在植物適應特殊生境以及響應生物與非生物脅迫時，類黃酮發揮重要的作用。在植物體內，類黃酮主要以糖基衍生物的形式存在，是植物花、葉、果實和種子的主要顯色物質，同時，類黃酮在植物體內也具有很重要的功能。類黃酮具有清除自由基和抗氧化的能力（Jovanovic et al， 1994），此外，類黃酮在人體中也具有多種生物活性，如抗氧化、抗病毒、血管舒張活性、抗癌和防衰老（Pietta， 2000； Heim et al， 2002）。

花青素（Anthocyanidin）為類黃酮化合物，是一種水溶性天然色素，廣泛存于自然界的植物中（Sarma et al， 1997）。花青素生物合成途徑是黃酮類代謝途徑中的一個分支途徑，苯丙氨酸是其生物合成的直接前體，經一系列酶促反應合成花青素。由苯丙氨酸合成花青素主要過程如下：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）作用下脫去氨基，形成肉桂酸；在肉桂酸羥化酶（C4H）的作用下羥基化，形成4香豆酸；在4香豆酸CoA連接酶（4CL）的作用下，形成4香豆酰CoA；4香豆酰CoA和丙二酰CoA在查爾酮合酶（CHS）的催化下合成查爾酮；由查爾酮異構酶（CHI）將其轉變成4，5，7三氫黃烷酮；4，5，7三氫黃烷酮在黃烷酮3羥化酶（F3H）的催化下形成二氫黃酮醇，這一階段產生的二氫黃酮醇可在不同酶的作用下轉化為花青素或其它類黃酮物質（二氫榭皮素和二氫楊梅黃酮等）（Holton & Cornish， 1995； WinkelShirley， 2001）。

黃烷酮3羥化酶（flavanone 3 hydroxylase，F3H）基因最早由Martin et al（1991）從金魚草中分離得到。對矮牽牛的研究表明，F3H是分子量為42 kD的單體蛋白，在這其中His220、His278、Arg222及Ser290氨基酸殘基對酶活起到了關鍵作用（Lukacin & Britsch， 1997）。研究發現，F3H基因在擬南芥、矮牽牛、玉米及苜蓿等多種植物中以單拷貝基因的形式存在，而在紫蘇中存在2～3個拷貝（Gong et al， 1997）。張華玲等（2010）克隆得到苦蕎F3H基因，并對其進行進行序列分析。結果表明，FtF3H基因長1 369 bp，編碼367個氨基酸，與葡萄、牽牛F3H的同源性達到80%左右。預測的FtF3H蛋白具有鐵離子結合位點及2酮戊二酸結合位點等典型結構。采用電子克隆法，獲得了紅花菜豆F3H基因的cDNA編碼序列，并采用生物信息工具對紅花菜豆F3H基因的性質進行研究。結果表明，紅花菜豆F3H基因開放閱讀框為2 228 bp，編碼375個氨基酸，與大豆F3H基因同源性為92% （Ma & Guo， 2014）。F3H基因在花青素合成及環境脅迫中發揮著重要作用。研究表明，阻斷擬南芥F3H基因表達能導致黃酮及花色素水平下降（Wisman et al， 1998）。紅砂在干旱和紫外線輻射脅迫中，F3H基因的表達量顯著上升，酶活性增強，植物花青素含量和抗氧化能力增強（Liu et al， 2013）。鹽脅迫下，F3H基因在茶和轉基因煙草中的表達量及酶活性都顯著增加（Mahajan & Yadav， 2014）。此外，枸杞F3H基因在轉基因煙草中過表達能夠增強其對干旱脅迫的耐受性（Song et al， 2016）。由此可見，當植物受到逆境脅迫時，F3H促進花青素的積累，增強抗氧化能力，從而抵御逆境。目前已陸續從擬南芥、矮牽牛、玉米、甘藍型油菜、苜蓿、蘋果、康乃馨、銀杏及苦蕎等多種植物中克隆得到F3H基因，但在檸條錦雞兒中未見報道。

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）為豆科錦雞兒屬的灌木類植物，具有較為發達的根系。主要生長于內蒙古西部、陜西北部、寧夏及甘肅（河西走廊）等地區 （李高等， 2013），生于半固定和固定沙地，是黃土高原植被建設的優良灌木植物。檸條錦雞兒具有廣泛的適應性和很強的抗逆性，能耐低溫及酷熱，也具有很強的抗旱能力，是荒漠、荒漠草原地帶的優質防風固沙的植物。另外，檸條錦雞兒是優良的可再生生物能源，它枝葉繁茂，產草量高，莖葉營養豐富，是畜牧業優良的灌木飼料，還具有抗風、不怕埋沒等特點 （劉龍會等， 2012； 楊杞等， 2013）。近年來，關于檸條錦雞兒的研究已受到人們越來越多的關注，選擇檸條錦雞兒為實驗材料，為我們的研究提供了更多可能性。

本研究以檸條錦雞兒為研究對象，從中克隆F3H基因，對F3H基因進行生物信息學分析，在不同的逆境處理下檢測F3H基因mRNA轉錄水平的變化，分析其在不同脅迫下的基因表達量，并克隆該基因的啟動子，對其啟動子的功能區進行分析，為研究F3H基因及花青素在逆境脅迫下的作用機制提供參考。

1材料與方法

1.1 材料與培養處理

以檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）為材料。于1/2 MS培養基中培養約45 d備用。培養條件：25 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照強度130 μmol·m2·s1。

低溫處理：將檸條錦雞兒放入4 ℃培養箱中分別處理0、12、24、36和48 h，光周期為16 h光照/8 h黑暗，處理時0 h開始先光照；鹽處理：在NaCl濃度為0、50、100、150和200 mmol·L1的培養液中分別處理檸條錦雞兒植株24 h；干旱處理：在PEG6000質量分數為5%、10%、15%和20%的培養液中分別處理檸條錦雞兒植株48 h；高溫處理：將檸條錦雞兒植株分別置于25、30、35、38和40 ℃培養條件下培養6 h。

本研究所用菌株為E.coli DH5α，克隆載體為pTG19T。引物合成及測序服務均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 檸條錦雞兒總RNA提取及反轉錄選取生長良好的檸條錦雞兒植株，按照Trizol（上海生工生物公司）說明書進行總RNA的提取。總RNA經過純度檢測后，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（TakaRa）試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。

1.2.2 RACE方法克隆檸條錦雞兒F3H基因cDNA全長檸條錦雞兒F3H基因中間保守片段克隆：從GenBank中下載已克隆得到的植物F3H基因序列，用DNAstar軟件MegAlign模塊進行序列比對，根據比對結果，設計簡并性引物Primer 1和Primer 2，Primer 3和Primer 4（表1）。以反轉錄得到的檸條錦雞兒cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產物凝膠回收，連入pTG19T載體，4 ℃過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37 ℃過夜培養，藍白斑篩選后挑取白斑進行菌液PCR檢測，挑選陽性克隆，送北京六合華大基因有限公司測序。

檸條錦雞兒F3H基因3′RACE克隆：提取檸條總RNA，按照3′Full RACE Core Set Ver.2.0（TakaRa）試劑盒說明書進行反轉錄及3′RACE擴增反應。以試劑盒中提供的兩個特異性引物3′RACE D1和3′RACE D2（表1）為下游引物，根據擴增得到的檸條錦雞兒F3H中間片段序列，設計3′RACE擴增上游引物3′RACE U1和 3′RACE U2（表1）。以反轉錄得到的cDNA為模板，3′RACE U1，3′RACE D1為引物進行第一次PCR擴增，以一擴產物為模板， 3′RACE U2，3′RACE D2為引物進行第二次PCR擴增，得到預期大小的片段，切膠回收，連接pTG19T載體，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆測序。

檸條錦雞兒F3H基因的5′RACE克隆：提取檸條錦雞兒總RNA，按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0（TakaRa）的說明書進行反轉錄及5′RACE擴增反應。以試劑盒中提供的兩個特異性引物5′RACE U1和 5′RACE U2（表1）為上游引物，根據擴增得到的檸條錦雞兒F3H中間片段序列，設計5′RACE擴增下游引物5′RACE D1和5′RACE D2（表1）。5′RACE U1和5′RACE D1為引物進行一次PCR擴增，再以一擴產物為模板，以5′RACE U2和5′RACE D2為引物進行二次PCR擴增，得到預期大小的片段，切膠回收，連接pTG19T載體，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆測序。

根據檸條錦雞兒F3H基因RACE測序結果與之前得到的中間片段進行拼接，得到全長基因，設計引物擴增F3H基因的全長，以驗證得到的序列是否正確。PCR產物純化回收后，連接載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，37 ℃過夜培養，藍白篩選陽性克隆，送華大基因公司測序。

1.2.3 實時熒光定量PCR以反轉錄得到的cDNA為模板，以ActinF，ActinR為管家基因引物， F3HDL U，F3HDL D為目的基因引物（表1），對檸條錦雞兒F3H基因的表達量進行分析。按照SYBR Premix Ex Taq TM（TakaRa）操作說明書于25 μL反應體系進行PCR擴增， 每個樣品做3個平行重復， 每

一種脅迫處理做3次生物學重復。

反應體系如下：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，F3HDL U、F3HDL D或ActinF、ActinR （10 μmol·L1）各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環；55～95 ℃每30 s漸進升高0.5 ℃，81個循環。擴增結束后，采用2-△△Ct法分析數據，確定基因的相對表達量。

1.2.4 克隆檸條錦雞兒F3H基因啟動子選取生長良好的檸條錦雞兒植株，用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TakaRa）試劑盒提取其幼嫩葉片中的基因組DNA，根據已知的檸條錦雞兒F3H基因全長序列設計特異性引物，按照Genome Walking Kit（TakaRa）試劑盒克隆CkF3H基因的啟動子序列。根據染色體步移的測序結果及CkF3H基因的全長序列設計一對基因特異性引物，以基因組DNA為模板，按照Premix Ex Taq DNA Polymerase（TakaRa）說明書進行PCR擴增，進一步驗證啟動子克隆的正確性。

1.2.5 檸條錦雞兒F3H基因的生物信息學分析用DNAstar軟件的Protean模塊對檸條錦雞兒F3H基因進行氨基酸組成成分和蛋白基本特征分析，用Clustal方法構建以氨基酸序列為基礎的系統進化樹；用在線工具SOPMA預測檸條錦雞兒 F3H蛋白的二級結構；根據生物信息學軟件TopPred （http：//services.cbib.Ubordeaux2.fr/pise/Toppred.htm1）、TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）、SOSUI （http：//bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui/） 在線分析檸條錦雞兒F3H蛋白的親水/疏水性以及跨膜結構域。用在線分析軟件PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析檸條錦雞兒F3H基因啟動子序列，根據啟動子序列中所含的功能元件預測啟動子的功能。

2結果與分析

2.1 CkF3H基因的克隆

利用已經克隆報道的植物F3H基因序列，通過分析在其保守區設計兩對簡并引物，從檸條錦雞兒葉片中提取總RNA，并以其反轉錄的cDNA為模板，擴增得到500 bp和400 bp左右的兩條單一條帶（圖1：A）。將這兩個基因片段經測序后拼接得到一條長度為760 bp的中間片段。再通過3′RACE和5′RACE分別擴增得到530 bp與400 bp大小的基因片段（圖1：B， C），經過測序后發現，與前面擴增得到的中間片段核苷酸序列有完全一致的重疊部分，說明以上克隆得到的片段均屬于同一條基因。

將擴增得到的中間片段以及3′RACE和5′RACE擴增得到的片段序列進行拼接，得到了一條全長1 437 bp的基因序列（圖2），包含一個1 095 bp的開放閱讀框（ORF），編碼364個氨基酸。起始密碼子ATG前面有一段115 bp的5′非翻譯區（5′UTR），終止密碼子TAG后面有一段227 bp的3′非翻譯區（3′UTR），包含15 bp的polyA。為了進一步確定以上拼接序列的正確性，我們用特異引物對全長序列進行了擴增克隆，經比對與拼接序列的核苷酸組成完全相同。

與GenBank數據庫中的序列進行比對，該片段與其它物種F3H基因的序列相似性為73%～89%，由此可以確定獲得的該序列片段屬于檸條錦雞兒中的F3H基因，我們命名為CkF3H。

2.2 CkF3H預測氨基酸序列與其他植物氨基酸序列比對分析

根據得到的CkF3H基因全長序列，利用Vised11軟件推導其氨基酸序列（圖2）。通過SOPMA對檸條錦雞兒F3H預測蛋白的二級結構進行預測，結果顯示：其蛋白包含37.09%的α螺旋（Alpha helix）、22.8%的延伸鏈（Extended strand）、11.26%的β轉角（Beta turn）和28.85%的無規則卷曲（Random coil）。

從Genbank中下載已經克隆得到的植物F3H基因序列，利用ClustalX 2.1軟件對檸條錦雞兒、紅豆草、蒺藜苜蓿、大豆、鷹嘴豆、煙草、擬南芥、玉米F3H基因編碼的氨基酸序列進行比對（圖3）。進一步分析發現，CkF3H與紅豆草OvF3H同源性最高，達到了89.3%，與蒺藜苜蓿MtF3H，大豆GmF3H，鷹嘴豆CaF3H，棉花GhF3H，兔眼藍莓VaF3H，擬南芥AtF3H的同源性分別為85.8%，85.0%，83.9%，79.3%，78.1%，73.6%。同時，利用MEGA 5.02軟件，對已報道的部分F3H蛋白進行了聚類分析，構建了F3H基因的系統進化樹（圖4）。

2.3 CkF3H基因啟動子的克隆及分析

以檸條錦雞兒中提取到的總DNA為模板，進行巢式PCR擴增，經過第3次PCR擴增后在600 bp處有一明顯條帶（圖5），回收后測序。結果表明，成

功克隆得到了CkF3H基因起始密碼子ATG上游啟動子序列468 bp。采用PlantCARE軟件進行基礎啟動子區及調控元件分析（圖6），發現該序列具有啟動子基本元件CAATbox和TATAbox。三個高水平轉錄調控因子5′UTR嘧啶密集區5UTR Pyrich stretch，分別位于-506 bp、-508 bp、-510 bp處。一個與缺氧有道相關的元件ARE，位于+178 bp處。一個光反應元件ATCTmotif、BoxI、BoxIII、Gbox、兩個Sp1，分別位于-36 bp、-261 bp、+382 bp、-257 bp、+229 bp和+302 bp。一個真菌誘導應答元件BoxW1，位于+298 bp。兩個分生組織特意表達調控元件CCGTCCbox，分別位于+460 bp和-603 bp。一個與Me Ja和ABA等激素響應相關的作用元件CGTCAmotif， 位于+422 bp處。一個胚乳中特意表達所需的正調控元件GCN4motif，位于-49 bp 處。一個與高溫脅迫相關的調控元件HSE，位于+263 bp處。一個赤霉素應答元件Pbox，位于+258 bp處。一個激素敏感型順式作用元件TGAelement，位于-438 bp處。一個茉莉酸甲酯作用元件，位于-422 bp處。一個WRKY轉錄因子結合位點W box，位于+298 bp處。此外，通過軟件分析還發現該啟動子還具有Cbox，MNF1等高效作用元件。

2.4 CkF3H基因表達分析

以檸條錦雞兒根、莖和葉中提取的mRNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，分析CkF3H基因在不同組織的表達。結果表明，CkF3H基因在檸條錦雞兒的根、莖、葉中均有表達，沒有組織特異性（圖7）在葉片中表達量最高，其次是莖和根。

通過在4 ℃低溫處理我們發現，CkF3H基因的表達受低溫脅迫誘導。將檸條錦雞兒植株在4 ℃處理12、24、36和48 h后，CkF3H基因轉錄水平與對照（0 h）相比，分別提高了25.81、7.62、52.71和23.75倍（圖8）。CkF3H基因的表達量呈現先上升后下降的趨勢，在4 ℃處理36 h達到最大，轉錄水平最高。

通過鹽脅迫處理我們發現，CkF3H基因的表達也受高濃度NaCl的誘導。當培養基中NaCl濃度為50、100、150和200 mmol·L1時，CkF3H基因的表達與對照相比，分別提高了2.53、4.06、4.86和3.51倍，其表達呈先上升后下降的趨勢。當NaCl濃度為150 mmol·L1時，CkF3H基因的轉錄水平達到最大值，表達最強 （圖9）。

通過模擬干旱脅迫我們發現，培養基中添加5%、10%、15%和20%的PEG6000后，CkF3H基因轉錄水平與對照相比，分別提高了2.62、28.25、52.35和22.94倍，其表達量也呈現先升高后下降的趨勢，在PEG6000質量分數為15%時達到最高 （圖10）。說明CkF3H基因在適應干旱脅迫的過程中發揮作用。

通過高溫脅迫處理我們發現，CkF3H基因轉錄水平的表達也受高溫誘導。將檸條植株在30、35、38和40 ℃的處理下，CkF3H基因的轉錄水平與對照相比，分別上升了76.64、34.3、37.27和89.26倍 （圖11），在40 ℃時，CkF3H基因的轉錄水平達到最大。以上結果表明CkF3H基因對高溫脅迫的誘導較為敏感。

3討論

黃酮類苯環上的羥基是具有抗氧化活性的關鍵基團，對氧自由基有很強的清除作用（郭春梅等， 2012； 陳季武等， 2002）。當植物處于逆境脅迫時，它可將自身的氫供給脂類化合物的自由基，抑制脂類的進一步氧化，從而減少膜質損傷。黃烷酮3羥化酶（F3H）是重要的生物合成中間產物酶，參與黃酮醇、兒茶酚、花青素以及原花青素的生物合成（Prescott & John， 1996）。研究表明，生物脅迫與非生物脅迫能夠誘導F3H基因的表達（Jeong et al， 2004）。在干旱、高鹽、低溫以及激素脅迫下，F3H基因的表達均有上升（Shinozaki & YamaguchiShinozaki， 1996）。許志茹等（2008）對蕪菁F3H在UVA誘導下的表達量進行分析，發現F3H基因的表達量與UVA處理的時間呈相關性。范敏等（2008）研究表明，馬鈴薯F3H基因的表達量在不同干旱脅迫下都有不同程度的增加，且葉中F3H基因受干旱誘導的時間比根中長，說明F3H基因參與了馬鈴薯的抗旱反應。

本研究從檸條錦雞兒中克隆了CkF3H基因，并分析了在逆境脅迫下其轉錄水平表達量的變化：在低溫、高鹽以及干旱脅迫下，CkF3H基因的表達量均呈現先升高后下降趨勢，且均高于對照水平。由此可見，CkF3H基因在檸條錦雞兒抵御低溫、高鹽和干旱脅迫過程中發揮了重要作用。其中，在低溫脅迫處理下，CkF3H基因在0、24、48 h時表達較低，12、36 h的表達量較高，可能受到光周期的影響 （圖8）；先前研究發現，在光處理條件下葡萄皮中F3H基因表達以及花青素含量均顯著高于黑暗處理（Azuma et al， 2012），將蘋果從暗處轉移至光照條件下，其表皮中F3H基因表達顯著上調（Feng et al， 2013）。因此，在低溫脅迫下，CkF3H基因表達可能受低溫及光照共同影響。此外，對CkF3H基因啟動子區進行生物信息學分析發現：其啟動子含有與光、ABA及高溫等脅迫誘導相關的順勢作用元件。CkF3H基因在轉錄水平表達量的變化也表明了該基因受高溫的誘導，且溫度越高，表達量變化越明顯。由于類黃酮在植物營養及生理方面具有重要作用，因此，了解類黃酮代謝途徑是非常必要的。克隆分析編碼此途徑中關鍵酶的基因，是認識類黃酮生物合成調控機制的重要途徑，也是進一步了解類黃酮生物學意義的基礎。

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