外源綠原酸緩解黑大豆SB鋁毒害的機理研究

江曉潔 李芳 王聞聞 陳宣欽

摘要： 該文研究了外源綠原酸（CGA）對Al脅迫下鋁敏感型黑大豆SB根生理生化指標以及根中脅迫相關基因表達的變化，探討外源CGA緩解SB根鋁毒害的效果及分子機理。以不同濃度Al和CGA處理SB，篩選出CGA緩解Al毒害的最佳濃度，測定Al含量、抗氧化系統酶活性、1433蛋白與H+ATP酶的表達、H+泵活性。結果表明：低濃度CGA能緩解Al脅迫下黑大豆SB根伸長抑制，并促進側根數目增加，而高濃度CGA的緩解效果下降；0.01 g·L1 CGA使Al脅迫下SB根尖Al含量與MDA含量下降，促進根系檸檬酸的分泌。RTPCR和Western Bloting分析表明0.01 g·L1 CGA促進Al脅迫下SB根中1433b、1433m、1433k和GHA2基因（質膜H+ATP酶）的表達，抑制MATE基因的表達。同時，0.01 g·L1 CGA能促進Al脅迫下質膜H+ATP酶蛋白磷酸化水平以及其與1433蛋白結合，且能提高質膜H+ATP酶和H+泵活性。因此推測外源CGA可能通過增加側根數，增強1433蛋白和質膜H+ATP酶基因蛋白表達水平和互作，彌補Al脅迫下MATE表達的抑制，增加檸檬酸的分泌，增強SB對鋁毒害的耐受性。

關鍵詞： 黑大豆SB， 綠原酸， 檸檬酸， 1433蛋白， H+ATPase， Al脅迫

中圖分類號： Q945.78

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06073409

Abstract： We investigated the influences of exogenous chlorogenic acid （CGA） on the physiological parameters and Al stressrelated gene expression of SB （Alsensitive black soybean） root under Al stress. A major goal of this report was to explore the alleviating molecular mechanism of exogenous CGA on Al toxicity in SB. SB seedings were cultured in water solution and treated with 50 μmol·L1 Al or CGA plus 50 μmol·L1 Al. The optimal concentration of CGA alleviating Al toxicity was screened. And we study the effects of optimal exogenous CGA on root tip Al content， the activities of antioxidant enzyme， the expressions of 1433 protein and H+ATPase， and the activity of H+ pump under 50 μmol·L1 Al stress. Low concentrations of CGA alleviated inhibition of root elongation caused by Al toxicity and promoted the increase of lateral root numbers under Al stress. However， the CGAalleviated effect was weaken with high concentration of CGA treatment. It was founded that the alleviation effect of 0.01 g·L1 CGA was the most significant. Exogenous 0.01 g·L1 CGA decreased the Al in root tips and MDA contents. And the citric acid content in root exudates of SB under Al stress was significantly increased due to the addition of exogenous 0.01 g·L1 CGA. Expression analysis showed that exogenous 0.01 g·L1 CGA enhanced the expression of three 1433 isoforms （1433b， 1433m， and 1433k） and increased the expression of GHA2 （plasma membrane H+ATPase） gene， but inhibited the gene expression of MATE in SB under Al stress. The results of immunoprecipitation（IP） showed that the phosphorylation of the PM H+ATPase was up regulated by the exogenous 0.01 g·L1 CGA， which could bind with 1433 protein under Al stress. Meanwhile， plasma membrane H+ATPase and H+ pump activities were both enhanced by exogenous 0.01 g·L1 CGA under Al stress. It was suggested that exogenous CGA may enhance the SB tolerance to Al stress by increasing the lateral roots number， compensating inhibition of MATE expression and interaction between them to increase citric acid exudation.

Key words： black soybean， chlorogenic acid， citric acid； 1433， H+ATPase； Al stress

酸性土壤主要分布在熱帶、亞熱帶地區和對食物要求量大的發展中國家，約占世界可耕種土壤的30%（Sasaki et al，2004）。酸性土壤中的鋁毒害嚴重抑制農作物生長與產量。鋁在土壤pH>7時基本以沉淀形式存在（硅酸鹽或氧化物），對植物無毒。當土壤pH<5時，鋁則會由沉淀形式轉化成為可溶的離子狀態，被植物吸收，造成傷害（Delhaize & Ryanp，1995）。氧自由基引起的膜脂氧化損傷幾乎是各種逆境脅迫對植物損傷的共同途徑和特征。植物體內存在清除氧自由基的酶和非酶抗氧化系統。低濃度Al脅迫下，小麥（孔繁翔和桑偉蓮，2004）、水稻（馬寶慧，2007）、八仙花（彭盡暉等，2013）、栝樓（周媛，2012）等植物中抗氧化酶活性隨著Al3+濃度的增加而升高。耐鋁豇豆品種T6 SOD，POD和CAT活性顯著高于鋁敏感豇豆品種S3（于力等，2012）。在1 000 mg·L1的高鋁毒環境下，抗氧化酶會受到不同程度的抑制，抑制作用與植物種類有關。大豆根系中SOD與CAT活性在高濃度Al脅迫下顯著下降（劉鵬等，2004）；而同樣在1 000 mg·L1Al脅迫下，蕎麥根系中SOD活性顯著降低，CAT活性有所升高（王保義等，2006）。植物體內存在非酶類抗氧化系統，主要包括各種還原性物質，如還原型谷胱甘肽（GSH）、a生育酚（aTOC）、抗壞血酸（AsA）與類胡蘿卜素（CAR）等 （馬寶慧，2007）。

鋁誘導的有機酸分泌是植物緩解Al毒的最重要途徑。在鋁毒脅迫下，植物根系有機酸的分泌受H+ATPase、多藥耐藥毒性物外排轉運蛋白（MATE）和1433蛋白等的調控。MATE轉運蛋白廣泛存在于植物中（梁鋒等，2011）。Al脅迫下，高粱與擬南芥根表皮MATE高表達（Chen et al，2012；Liu et al，2009），促進檸檬酸的外轉運，緩解Al毒害。質膜H+ATPase與檸檬酸的分泌量也有關。Al脅迫下大豆質膜H+ATPase基因表達上調，根尖檸檬酸的分泌增加，加入釩酸鹽（VA，H+ATPase抑制劑）后，H+ATPase活性與檸檬酸分泌量顯著下降（Shen et al，2005）。1433蛋白普遍存在于植物中，能與H+ATPase特異結合，促進H+ATPase磷酸化。Al脅迫下，蠶豆根系質膜H+ATPase與1433蛋白的表達上調，H+ATPase磷酸化水平增加，質膜H+ATPase與H+泵活性顯著增強，檸檬酸分泌量增加（郭傳龍等，2015；Chung et al，1999）。

綠原酸（CGA），又名3O咖啡酰奎尼酸，是一種廣泛存在于植物體內酚性成分，是植物有氧呼吸過程產生的一種苯丙氨酸代謝物（林學政等，2005；陳紹華等，2009）。當植物受到生物脅迫時，一方面CGA作為植保素，破壞病原菌細胞壁，直接制劑抑制病原菌的生長（周志娥等，2014）；另一方面，CGA也可轉變成為木質素與軟木脂，使被入侵的傷口迅速木質化，防止病菌進一步入侵。當植物受到非生物脅迫時，植物體內的CGA含量急劇增加，參與脅迫響應（林學政等，2005）。此外，綠原酸本身作為一種還原劑，對羥基自由基具有清除作用，對植物組織的氧化損傷具有緩解作用（陳紹華等，2008）。目前未見有關綠原酸對Al脅迫下的植物生理生化，生長發育和逆境相關基因表達的影響。

本研究使用水培法，以黑大豆SB（Al敏感型）為材料，研究外源綠原酸對Al脅迫下SB根系相關生理生化指標的影響，探討SB根中脅迫相關基因表達的變化，揭示外源CGA緩解SB根系鋁毒害的生理及其分子機理。

1材料與方法

1.1 材料培養與處理

參照王聞聞等（2014）的方法培養黑大豆SB，3 d后，用含有AlCl3和CGA+AlCl3的營養液（0.5 mmol.L1 CaCl2，pH 4.5）處理幼苗，AlCl3濃度為50 μmol·L1，CGA濃度為0.004 g·L1，0.01 g·L1，0.02 g·L1，0.04 g·L1，并以營養液處理的幼苗為對照，處理24 h、3 d、7 d后，測量根伸長以及側根數目測定。

將培養的SB幼苗置于處理液（分別含有50

μmol·L1 AlCl3和0.01 g·L1 CGA+50

μmol·L1 AlCl3的營養液）中，以營養液處理為對照。分別處理0、2、4、6、8、12、18、24 h后，取植物的根稱重后用于根尖Al含量測定；用液氮處理剩余的植物根后放置超低溫冰箱（-80 ℃）保存，用于其它檢測分析。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 相對根伸長率及側根數目的測定處理植物前，對根基部進行標記，并測量比較處理前后從根尖頂端到標記點距離的差異，處理前后測量值之差為根伸長量（周志娥等，2014）。側根數目的測定：分別計數不同處理前后長度大于1 mm的側根數目，求其平均值 （王聞聞等，2014）。

1.2.2 根系分泌物檸檬酸收集及含量測定取6只50 mL的開口試管，分別加入10株長勢一致的SB幼苗及AlCl3 50

μmol·L1 和CGA（0.004，0.01，0.02，0.04 g·L1）的營養液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）中，以營養液（0.5 mmol·L1 CaCl2，pH 4.5）處理為對照。處理24 h后，將樣品用真空干燥儀常溫下干燥后加入4 mL蒸餾水溶解樣品。溶解的樣品過陽離子交換樹脂提純，用梯度的硫酸銨洗脫。將洗脫液濃縮回收后1 mL 50%的甲醇溶解過濾，再用HPLC法進行樣品檸檬酸含量分析。檢測器波長為210 nm，流速0.8 mL·min1，柱溫30 ℃，根據峰面積確定樣品中的檸檬酸含量 （王聞聞等，2014）。

1.2.3 根尖Al含量的測定將處理過的根用蒸餾水清洗3次，洗凈根表面附著的Al，將根表面的水分吸干，裝入信封中，再放入70 ℃的烘箱2～3 d后烘干直至恒重。烘干的樣品經500 ℃ 高溫灰化后，加入1 mL優級純硝酸浸提過夜得到提取液，提取液用蒸餾水定容至50 mL。用ICPAES測定根中金屬Al含量（Lan et al，2016）。

1.2.4 MDA和H2O2含量的測定使用硫代巴比妥法（TBA法）（張志良和瞿偉菁，2003）測定MDA含量。H2O2含量測定使用二甲基酚橙法（李忠光等，2007）。

1.2.5 根尖抗氧化系統酶活性的測定取冷凍保存的樣品參照Chen et al（2012）的方法測量根尖抗氧化系統酶（SOD、POD與CAT）活性。

1.2.6 基因表達分析取置于-80 ℃冰箱凍存的SB根尖，于液氮中研磨呈粉末后，加入適量Trizol 試劑 （Invitrogen）提取RNA，使用MMuLV反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。根據質膜中 H+ATPase的編碼基因vha2 和 sb1433保守區的cDNA序列，設計合適的引物，以28sRNA為內參（王杰等，2015），參考王聞聞等（2014）所用的引物序列進行RTPCR分析。

1.2.7 免疫共沉淀分析按照Yan et al（2002）的方法提取質膜蛋白，參照Jahn et al（1997）的方法檢測SB根系中質膜1433蛋白與H+ATPase的相互作用。20 μg的膜蛋白在 10%PAGE上分離后，用半干轉膜法將分離的膜蛋白轉至PVDF膜上。電轉完畢后，使用質膜 H+ATPase和1433蛋白抗體做一抗進行Western分析，加入二抗觀察結果。

1.2.8質膜H+ATPase活性和H+泵活性的測定參照Yan et al（2002）的方法提取質膜蛋白，紫外分光光度計法測定H+泵的活性。

1.3 數據統計分析

使用Prism5和DPS 7.05對數據進行統計分析，并比較顯著性差異。

2結果與分析

2.1 外源CGA對Al脅迫下SB根伸長和側根數的影響

根伸長抑制是Al毒對植物根傷害的最直接表現。根伸長抑制通常通過根相對伸長率（RRG）這一指標反應。本研究在50 μmol·L1 Al溶液中分別加入添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 的CGA處理SB幼苗24 h后，測定根長，并與正常的營養液和單獨Al處理作為對照，計算根的相對伸長率。圖1結果顯示，50 μmol·L1 Al處理后，會一定程度抑制了SB根伸長，與正常營養液處理相比，Al處理下SB根相對伸長率（RRG）有所降低。0.01 g·L1 CGA處理下SB的RRG顯著高于單獨Al處理，甚至高于正常營養液處理，提示0.01 g·L1 CGA處理能緩解Al脅迫誘導的根伸長抑制。其它濃度的CGA處理下根相對伸長率雖然高于單獨Al處理，但二者之間并無顯著差異。側根數統計結果表明，處理3 d后，Al脅迫下側根數顯著低于正常對照，Al脅迫除抑制根伸長，還可抑制側根生長發育。而外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA處理的SB側根數目顯著高于單獨Al處理。除0.04 g·L1CGA處理外，50 μmol·L1Al溶液中分別添加0.004、

0.01、0.02 g·L1 CGA處理下側根數與正常對照水平相當。處理7 d后，外源添加0.004、0.01、0.02、0.04 g·L1 CGA處理下的側根數目仍高于單獨Al處理，且0.01 g·L1 CGA處理側根數目高于其它濃度CGA處理。

2.2 外源CGA對Al脅迫SB根尖檸檬酸分泌量的影響

植物根系有機酸分泌外排是植物抗鋁毒害的最重要機理。Al處理與對照相比SB根系分泌物中檸檬酸含量顯著增加。Al處理下外源添加CGA不同程度增加了Al脅迫下SB根系檸檬酸分泌量。SB根系檸檬酸分泌隨著CGA濃度的增加首先呈現先升高的趨勢，達到最適的濃度后，就呈現下降的趨勢，根據CGA對SB根分泌檸檬酸影響的變化特點，外源0.01 g·L1 CGA處理下檸檬酸分泌量最高，證實該濃度對緩解Al脅迫的效果可能優于其它濃度（圖2）。同時，在外源0.01g·L1CGA處理Al脅迫下的大豆根的不管是根伸長長度還是側根數目均顯著高于其他濃度，說明在外源0.01 g·L1 CGA濃度緩解Al對SB脅迫的效果最明顯。因此，選擇0.01 g·L1 CGA作為其它實驗的處理濃度。

2.3 外源CGA對Al脅迫下SB根尖Al含量的影響

0.01 g·L1 CGA單獨處理與對照相比，SB根尖Al含量無顯著差異。由此可見，CGA本身對根尖Al含量并無顯著的影響。50

μmol·L1 Al脅迫下SB根尖鋁含量顯著高于CGA單獨處理和對照。50

μmol·L1 Al脅迫下添加0.01 g·L1 CGA后，根尖鋁含量顯著低于單獨Al處理，說明CGA能顯著減少Al脅迫下SB根尖鋁的積累（圖3）。

2.4 外源CGA對Al脅迫下SB根尖MDA和H2O2含量的影響

Al單獨處理使SB根中MDA含量明顯提高。外源添加CGA后，Al誘導的MDA含量的升高顯著降低，恢復到對照水平，提示CGA對Al脅迫誘導的膜脂過氧化損傷具有緩解作用（圖4：A）。Al脅迫和CGA處理，H2O2含量與對照無顯著差異，Al脅迫引起的膜脂過氧化，MDA含量增加，并不通過H2O2積累（圖4：B）。

2.5 外源CGA對Al脅迫下SB根尖抗氧化酶活性的影響

Al處理后，SB根系可溶性蛋白含量要顯著高于對照，推測Al脅迫會促使一些基因過表達；然而在Al脅迫下外源施加CGA后，可溶性蛋白含量雖略高于Al單獨處理，但二者之間并無顯著差異，CGA并不增加Al脅迫下可溶性蛋白含量 （圖5：A）。與對照相比，Al處理下SB根中SOD活性顯著降低，CAT和POD活性無顯著差異；外源CGA對Al脅迫下SOD、POD、CAT活性沒有顯著影響（圖5）。

2.6 外源CGA對Al脅迫下SB根中1433蛋白、質膜H+ATPase和MATE基因表達的影響

由圖6可知，與對照相比，Al脅迫下SB根1433基因表達水平不同程度增強。外源添加CGA后，1433b、1433m和1433k表達水平略高于Al單獨處理的植株；而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n表達水平低于Al單獨處理。Al處理下， GHA2mRNA表達水平高于對照，外源添加CGA后，GHA2mRNA表達水平進一步增加，Al脅迫下， MATE基因mRNA水平顯著高于對照，與單獨Al處理相比，外源添加CGA后MATE基因的表達水平略有下降，但仍高于對照（圖6）。

2.7 外源CGA對Al脅迫下SB根中質膜H+ATPase蛋白磷酸化水平及其與1433蛋白互作、H+ATPase活性及H+泵活性的影響

Al處理下，SB根中質膜H+ATPase的磷酸化水平高于對照，外源添加CGA后，SB根中質膜H+ATPase的磷酸化水平進一步增加（圖7）。與質膜H+ATPase的磷酸化水平結果相似，Al處理下1433蛋白與磷酸化質膜H+ATPase的結合能力高于對照，添加外源0.01 g·L1 CGA后1433蛋白與磷酸化質膜H+ATPase的結合水平增加，高于單獨Al處理和對照。CGA促進了Al脅迫下1433蛋白與磷酸化質膜H+ATPase的結合。

添加外源CGA后，Al處理下SB根中質膜H+ATPase的活性高低依次為Al+0.01 CGA>Al>CK。H+泵活性的結果與質膜H+ATPase活性的結果基本一致，50 μmol·L1 Al溶液添加0.01 g·L1 CGA處理能增強H+泵的活性，單獨Al處理下的H+泵活性位于對照組與CGA處理二者之間（圖8）。

3討論

激素在植物應答緩解環境脅迫中起著重要的調節作用，如水楊酸、脫落酸、茉莉酸、乙烯、多肽激素等（徐偉和嚴善春，2005）。Al脅迫下紫花苜蓿IAA含量顯著下降（任曉燕，2013）。CGA是IAA的保護劑，抑制IAA氧化反應，緩解Al脅迫對根系伸長的抑制作用（Paul et al，1964）。本研究中，外源低濃度CGA（0.004和0.01 g·L1 ）緩解Al對SB根伸長具有抑制作用的同時，對側根的生長發育具有促進作用，而高濃度0.02和0.04 g·L1CGA的緩解和促進效果下降。有機酸分泌是植物抗鋁毒害的最重要途徑。Al脅迫下，0.01 g·L1 CGA處理后，SB根系檸檬酸的分泌量顯著提高，而其它濃度的CGA處理下，檸檬酸分泌量變化并不明顯，可見，Al脅迫下，0.01 g·L1 CGA對SB根系具有最顯著的緩解作用。此外，我們注意到高濃度0.02和0.04 g·L1 CGA緩解Al毒害的效果下降，推測其可能的原因是被細胞吸收后，糖苷鍵水解，生成了3，4二羥基苯丙烯酸，其羥基和羧基能電離出H+離子；高濃度CGA被植物細胞吸收后，破壞細胞內環境的酸堿穩態，造成細胞代謝紊亂，因而緩解作用下降。

Al3+誘導植物產生和積累大量的活性氧，破壞正常組織的結構與功能，甚至導致死亡。本研究中，Al脅迫下MDA含量顯著增加，暗示Al脅迫引起膜脂過氧化。添加外源CGA后，MDA含量顯著下降，CGA能夠緩解Al脅迫引起的脂質過氧化。外源CGA和單獨鋁處理下H2O2的含量與對照無明顯差異，Al脅迫引起的膜脂過氧化，MDA含量增加，并不是H2O2的積累氧化造成的。外源CGA和單獨鋁處理與對照相比，SOD活性顯著下降，POD和CAT活性與對照相比無顯著差異，CGA對Al脅迫下抗氧化酶活性并無顯著的影響和調控作用。CGA分子中具有氫自由基結構，能夠清除植物體內的活性氧，減輕自由基對組織的氧化脅迫（胡宗福等，2006）。因此我們推測CGA通過其還原用，清除Al脅迫產生的除H2O2外的其它活性氧，緩解膜脂過氧化，減少MDA的產生。

植物受到Al3+刺激時，根系分泌大量有機酸，如檸檬酸、蘋果酸等，這些有機酸能與細胞外的Al3+結合，防止Al3+進入細胞內造成對植物的損害（郭傳龍，2013）。檸檬酸通道蛋白屬于MATE家族，能轉運檸檬酸至胞外，螯合細胞外的Al3+（謝小東等，2011）。本研究中，SB在Al脅迫下，加入0.01 g·L1CGA后，檸檬酸的分泌量雖然顯著增加，但MATE表達量卻較單獨Al脅迫處理略有下降，綠原酸對MATE表達具有一定的抑制效應。可見，綠原酸并不通過上調MATE的表達，增加Al脅迫下SB根系檸檬酸的分泌。結合根伸長抑制試驗，0.01 g·L1CGA能顯著增加Al脅迫下SB側根數目。因此，我們推測可能是側根數目的增多，生物量增加，彌補了MATE的基因表達水平的下降造成的差異，最終使檸檬酸分泌量增加從而緩解Al脅迫。

植物中1433基因家族至少有十五種亞型，這些1433蛋白能與靶細胞不同程度結合，調控植物生長發育和脅迫響應。在酸性土壤中，Al3+進入細胞內，激活1433蛋白，并與H+ATPase特異性結合，使其磷酸化和H+泵活性增加，增強檸檬酸的分泌作用（周志娥等，2014）。與單獨Al脅迫相比，CGA處理后的1433蛋白表達各有不同，其中三種1433蛋白（1433b、1433k和1433m）的表達水平均略微上調，而1433c、1433e、1433f、1433g、1433i、1433j和1433n基因表達水平下降。同時與單獨Al處理相比，CGA處理后，質膜H+ATPase的磷酸化水平，其與1433的結合能力，H+泵活性均增加。因此，推測CGA還可能通過調控1433蛋白的表達，增加質膜H+-ATP酶的磷酸化水平，增強H+泵的活性使檸檬酸分泌量增加，緩解Al對SB的毒害。至于CGA如果具體調控哪種1433蛋白亞型，需要進一步研究和驗證。

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