正交試驗優化滇重樓核苷提取工藝

楊敏 郭冬琴 沈昱翔 潘興嬌 張杰 張靜 李昌玲 周濃

摘要：【目的】優化滇重樓核苷的提取工藝條件，為滇重樓資源的開發和利用提供技術支持。【方法】以滇重樓根莖為試驗材料，6種核苷類物質（胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷）總提取量為考察指標，采用高效液相色譜法測定其提取量，先分析超聲波提取法和熱水浸提法對滇重樓核苷提取效果的影響，然后在單因素試驗的基礎上，以甲醇體積分數、料液比、提取時間和提取次數為考察因素，采用L9（34）正交試驗對滇重樓核苷類物質提取工藝進行優化，確定最佳工藝條件。【結果】超聲波提取法得到的滇重樓根莖中6種核苷類物質總提取量高于熱水浸提法；4個因素對滇重樓核苷總提取量的影響排序為甲醇體積分數>提取時間>提取次數>料液比，最佳提取工藝條件為：以純凈水（甲醇體積分數為0）為提取溶劑，在料液比1∶10（g/mL）、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取2次，得到滇重樓根莖中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的總提取量為1.4216±0.0198 mg/g，高于理論值1.3434 mg/g。【結論】正交試驗優化得到的滇重樓核苷超聲波提取工藝操作簡便、穩定可靠，較熱水浸透法的提取效率高，適合用于滇重樓核苷的提取。

關鍵詞： 滇重樓；核苷；正交試驗；提取工藝；優化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0876-07

Optimization of extraction of nucleosides from Paris polyphylla var. yunnanensis by orthogonal test

YANG Min1， GUO Dong-qin2， SHEN Yu-xiang 3， PAN Xing-jiao1， ZHANG Jie2，

ZHANG Jing 2， LI Chang-ling 2， ZHOU Nong 1，2*

（1 College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali， Yunnan 671000， China； 2 College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404000， China； 3 College of Agriculture，

Anshun University， Anshun， Guizhou 561000， China）

Abstract：【Objective】The technical conditions of extracting nucleosides from Paris polyphylla var. yunnanensis were optimized， which provided technical support for the exploitation and utilization of P. polyphylla var. yunnanensis. 【Method】With rhizome of P. polyphylla var. yunnanensis as experimental material and total extracted amount of six nucleosides（cytidine，uridine，guanosine，thymidine，adenosine and 2'-deoxyadenosine） as examining indexes，high performance liquid chromatography（HPLC） method was adopted to determine the extraction amount. First， the effects of ultrasonic extraction and hot water extraction on the extracted amount of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis were analyzed， then based on single factor experiments， methanol volume fraction， material liquid ratio， extraction time and extraction frequency were selected as experimental factors. Extraction of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis was optimized by using L9（34） orthogonal experiment to select the optimal technical conditions. 【Result】The total extracted amount of six nucleosides by ultrasonic extraction was higher than that by hot water extraction. The effects of four experimental factors on total extracted amount of six nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis were ranked as follows： methanol volume fraction>extraction time>extraction frequency>material-liquid ratio. The optimal extraction conditions were as follows： pure water（methanol volume fraction was 0） was used as extraction solvent， material-liquid ratio 1∶10（g/mL）， extraction time 60 min at 30 ℃ and extracting twice. Under these conditions， the total extracted amount of cytidine， uridine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine in rhizome of P. polyphylla var. yunnanensis was 1.4216±0.0198 mg/g， which was higher than theoretical value 1.3434 mg/g. 【Conclusion】The ultrasonic extraction method optimized by orthogonal test is simple and reliable， the extraction rate of ultrasonic extraction is higher than hot water extraction. It is suitable for the extraction of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis.

Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis； nucleoside； orthogonal test； extraction process； optimization

0 引言

【研究意義】滇重樓為百合科植物云南重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）的干燥根莖，為常用清熱解毒、消腫止痛藥之一（國家藥典委員會，2015），臨床上常用于治療出血、腫瘤和炎癥性疾病等（趙保勝等，2011；王嵐等，2014）。目前已從滇重樓根莖中分離出甾體皂苷、核苷類、黃酮類、多糖類、氨基酸類等活性成分（趙保勝等，2011；周濃等，2016），其中核苷類具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗缺血性損傷、調節免疫功能及抗病毒等多種生物活性（Lee et al.，2003；張雪梅等，2012），廣泛應用于功能性食品和藥品等方面（劉洋等，2012；房舒舒等，2016），說明滇重樓核苷在醫藥保健產業中具有一定的應用潛力。因此，如何有效地提取滇重樓根莖中的核苷類物質，對開發利用滇重樓具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關重樓有效成分提取的研究主要集中在皂苷、多糖和黃酮類，其中皂苷的提取方法有超聲波提取（蔣雪等，2006；李維莉等，2010；劉江等，2016）、加熱回流提取（孫治國等，2007）和微波提取（喻祖文等，2013）等，超聲波提取工藝通常采取正交試驗，選取溶劑體積分數、提取時間、料液比、提取次數、提取溫度等因素進行優化考察。關于多糖提取，劉蕓等（2014）采用Box-Behnken響應面法對陜西產重樓中多糖的超聲提取工藝進行優化，在溫度72 ℃、超聲功率330 W、時間25 min、液料比14∶1（mL/g）的優化條件下，得到重樓中多糖的平均提取率為3.87%；周濃等（2014a）對滇重樓多糖的回流提取、熱水浸提和超聲波輔助提取3種提取工藝進行對比研究，結果表明，3種提取方法對滇重樓多糖提取率影響差異不顯著，但超聲波輔助提取較熱水浸提和回流提取具有能耗低的優點；之后又對滇重樓總黃酮的提取工藝進行研究，得到最佳提取工藝：以甲醇為提取溶劑，回流提取2次，每次2 h，料液比1∶60（g/mL）（周濃等，2014b）。此外，本課題組（潘興嬌等，2016；周濃等，2016）在前期研究中利用超聲波輔助提取滇重樓中水溶性成分，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定滇重樓根莖中水溶性成分含量，結果發現其水溶性成分主要是核苷類物質，尤其以胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷含量較高。【本研究切入點】目前有關重樓核苷類成分的提取工藝研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以滇重樓根莖為原料，選取甲醇體積分數、料液比、提取時間和提取次數為考察因素，采用L9（34）正交試驗優化滇重樓核苷類物質的提取工藝條件，以期為滇重樓資源的深加工及其在醫藥保健方面的開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

滇重樓藥材采自云南省麗江市石鼓鎮栽培基地，經重慶三峽學院生命科學與工程學院郭冬琴副教授鑒定為百合科植物云南重樓的干燥根莖，洗凈后35 ℃下干燥至恒重，粉碎過50目篩，密閉貯藏備用。尿苷、胸苷和腺苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110887-200202、101215-201401和110879- 200202，胞苷、鳥苷和2'-脫氧腺苷對照品購自南京都萊生物技術有限公司，純度經HPLC峰面積歸一化法計算，均大于98%；甲醇色譜純購自德國默克公司，試驗用水為娃哈哈牌純凈水。

主要儀器設備：LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津制作所）；SB-5200DTN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，超聲波功率300 W，工作頻率40 kHz）；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；CP225D型分析天平（德國賽多利斯集團）。

1. 2 6種核苷類物質的HPLC測定

參照潘興嬌等（2016）的方法進行胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷HPLC測定。色譜柱：Venusil MP C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A相為甲醇，B相為水，進行梯度洗脫（0～10 min，1% A～5% A；10～15 min，5% A～15% A；15～22 min，15% A～17% A；22～26 min，17% A～20% A；26～30 min，20% A～22.5% A）；檢測波長260 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35 ℃。

1. 3 提取方式選擇

在目前有關核苷和堿基提取方法的文獻中，多采用超聲波提取法（Duan et al.，2011；周濃等，2016）和熱水浸提法（陳家念等，2014），故本研究主要考察這兩種方法對滇重樓根莖中核苷類提取量的影響，以獲得最佳的提取效率。

1. 3. 1 超聲波提取滇重樓中核苷類物質 精密稱取滇重樓粉末20.0 g，置于500 mL具塞錐形瓶中，加入400 mL蒸餾水，混勻，30 ℃條件下超聲波提取15 min，取出后放至室溫，搖勻，分批次取50 mL提取液倒入離心管中，4000 r/min離心10 min，混合后用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1. 3. 2 熱水浸提滇重樓中核苷類物質 精密稱取滇重樓粉末20.0 g，置于500 mL具塞錐形瓶中，加入400 mL蒸餾水，混勻，85 ℃水浴浸提24 h，取出后放至室溫，搖勻，分批次取50 mL提取液倒入離心管中，4000 r/min離心10 min，混合后用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1. 4 單因素試驗

精密稱取滇重樓粉末20.0 g，置于500 mL具塞錐形瓶中，利用超聲波提取法（超聲波功率300 W，提取溫度30 ℃），選取甲醇體積分數（0、15%、30%、50%、70%和100%）、提取時間（15、30、60和90 min）、料液比（1∶10、1∶20、1∶40和1∶60 g/mL）、提取次數（1、2、3和4次）4個因素進行試驗，研究這4個因素對滇重樓6種核苷類物質總提取量的影響。分別在1.3項色譜條件下進樣，進行峰面積測定，根據c樣品/c對照品=A樣品/A對照品，計算滇重樓根莖中6種核苷類物質的總提取量。

1. 5 正交試驗優化提取工藝

根據單因素試驗結果，選擇對滇重樓根莖中核苷類物質總提取量有意義的因素水平，采用L9（34）正交試驗優化滇重樓核苷提取工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

1. 6 統計分析

采用SPSS 22.0對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 樣品的液相色譜測定結果

由圖1可知，在1.2色譜條件下，均能在30 min內較好地分離出胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷，與相鄰化學成分峰能夠達到基線分離，分離度均大于1.52，且峰形良好。

2. 2 提取方式的選擇結果

由于采用超聲波提取法提取滇重樓根莖中6種核苷類物質得到的總含量（1.0274±0.0131 mg/g）明顯高于熱水浸提法（0.6689±0.0437 mg/g），故選擇超聲波提取法進行后續試驗。

2. 3 單因素試驗結果

2. 3. 1 甲醇體積分數對滇重樓核苷提取量的影響 在料液比1∶20、提取時間30 min、超聲波提取1次的條件下，考察不同甲醇體積分數對滇重樓核苷提取量的影響。由圖2可知，滇重樓根莖中6種核苷類物質在不同甲醇體積分數條件下的提取效果存在差異。胞苷提取量隨甲醇體積分數的增加呈先降低后升高再降低的變化趨勢，其中在0～30%和50%～100%范圍內呈降低趨勢，在30%～50%范圍內呈升高趨勢，各甲醇體積分數的胞苷提取量間存在顯著差異（P<0.05，下同）；尿苷提取量在甲醇體積分數為0時最高，隨著甲醇體積分數的增加，呈直線下降趨勢；鳥苷和腺苷提取量在甲醇體積分數為0的條件下也最高，但隨著甲醇體積分數的增加呈先降低后略有升高再降低的變化趨勢；胸苷提取量隨甲醇體積分數的增加呈降低趨勢，但變化不明顯；2'-脫氧腺苷提取量在甲醇體積分數為30%時達最大值，顯著高于其他甲醇體積分數。從6種核苷類物質的總提取量來看，隨著甲醇體積分數的增加，總提取量逐漸降低，在甲醇體積分數為0（純水）時最高，故本研究選擇純凈水作為滇重樓核苷類物質的提取溶劑。

2. 3. 2 提取時間對滇重樓核苷提取量的影響 以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶20、超聲波提取1次的條件下，考察不同提取時間對滇重樓核苷提取量的影響。由圖3可知，提取時間在90 min內，樣品溶液中胞苷和尿苷提取量隨提取時間的延長呈逐漸降低趨勢，但遞減速率小，表明這兩種核苷對提取時間不敏感；鳥苷提取量隨提取時間的延長呈先升后降再升的變化趨勢，提取時間為30 min時提取量達最大值，顯著高于其他提取時間；胸苷提取量隨提取時間的延長呈逐漸升高趨勢，但60 min后趨于平緩；腺苷提取量隨提取時間的延長呈先升高后降低趨勢，提取時間為30 min時提取量達最大值；2'-脫氧腺苷提取量隨提取時間的延長呈先降低后升高再略有降低的變化趨勢。從6種核苷類物質總量來看，其提取量隨提取時間的延長呈先升高后降低再略有升高的變化趨勢，30 min的提取量最高，之后顯著下降，因此最佳提取時間為30 min。

2. 3. 3 料液比對滇重樓核苷提取量的影響 以純凈水為提取溶劑，在提取時間30 min、超聲波提取1次的條件下，考察不同料液比對滇重樓核苷提取量的影響。從圖4可看出，胞苷和胸苷提取量隨料液比的減小呈先升高后降低的變化趨勢，在料液比為1∶20時提取量達最大值，顯著高于其他料液比的提取量；在料液比為1∶10～1∶20的范圍內，尿苷和腺苷提取量快速升高，超過1∶20后呈快速降低趨勢；鳥苷提取量在料液比為1∶10～1∶60的范圍內變化不明顯；2'-脫氧腺苷提取量隨料液比的減小呈逐漸升高趨勢，超過1∶40后趨于平緩。從滇重樓6種核苷類物質總提取量來看，其在料液比1∶10～1∶20的范圍內快速升高，1∶20時達最大值，之后呈顯著下降趨勢，因此，選擇1∶20為最佳料液比。

2. 3. 4 提取次數對滇重樓核苷提取量的影響 以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶20、提取時間30 min的條件下，考察不同提取次數對滇重樓核苷提取量的影響。從圖5可看出，對滇重樓核苷進行第1次超聲波提取，6種核苷類物質總提取量達0.8715 mg/g，占4次提取總量的87.89%，提取出大部分核苷類物質，雖然隨著提取次數的增加，提取量仍有升高，但考慮到增加提取次數將極大增加成本投入，故認為核苷提取1次即可。

2. 4 滇重樓核苷提取工藝條件的優化結果

綜合單因素試驗結果，考察甲醇體積分數（A）、提取時間（B）、料液比（C）和提取次數（D）對胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷6種核苷類物質總提取量的影響。由表2可知，極差R排序為RA>RB>RD>RC，即甲醇體積分數對6種核苷類物質總提取量影響最大，其次是提取時間和提取次數，料液比影響最小。根據極差分析得到滇重樓根莖中核苷提取的最佳工藝條件為A1B3C1D2，即以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶10、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取2次，總提取量理論值為1.3434 mg/g；而根據直觀分析得到滇重樓根莖中核苷提取的最佳工藝條件為A1B3C3D3，即以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶40、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取3次，得到6種核苷類物質總提取量為1.3082 mg/g。極差分析結果與直觀分析結果不同，故需進行最佳工藝條件的驗證試驗。

2. 5 最佳工藝條件的驗證結果

精密稱取滇重樓粉末20.0 g，置于500 mL具塞錐形瓶中，以最佳工藝條件提取，按1.3色譜條件進行測定，設3次平行。滇重樓根莖中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷6種核苷類物質總提取量為1.4216±0.0198 mg/g，高于理論值1.3434 mg/g，表明優化的工藝條件（以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶10、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取2次）有效提高了核苷類物質的提取量，且合理、可行。

3 討論

目前，大多數核苷提取工藝優化的研究集中在貝母、黨參、蟲草等藥用植物，且多利用超聲波提取和熱水浸提方法，以核苷總量為考察指標（江寶紅等，2011；王麗芝等，2011；陳家念等，2014；張靜等，2016）。本研究通過對比超聲波提取和熱水浸提兩種提取方式對滇重樓根莖中核苷類物質提取量的影響，發現超聲波提取的效果更佳，故采用此法進行后續研究，并通過單因素試驗和正交試驗考察甲醇體積分數、提取時間、料液比和提取次數等因素對滇重樓根莖中核苷類物質提取量的影響，結果表明，甲醇體積分數是影響滇重樓根莖核苷總提取量的最主要因素，而料液比的影響較小，與張靜等（2016）采用超聲波輔助提取川黨參核苷時，發現甲醇體積分數是影響川黨參核苷提取量的主要因素的研究結果一致。本研究通過正交試驗優化得到滇重樓核苷的最佳提取工藝條件：以純凈水為提取溶劑，在料液比1∶10、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取2次，提取量達1.4216±0.0198 mg/g，可反映滇重樓根莖中核苷類物質的實際含量，為進一步開發其藥用價值提供參考。

中藥材傳統多以水煎煮為主，其水溶性成分的生物活性和物質基礎一直備受關注（王麗芝等，2011）。而滇重樓的水溶性化學成分主要是核苷類物質，與滇重樓生物活性（抗腫瘤、抗病毒、調節免疫等）具有一定的相關性（陳源紅等，2013；潘興嬌等，2016）。與傳統加熱回流和浸提相比，超聲波提取可縮短提取時間，降低提取溫度（李維莉等，2010），本研究優化的提取工藝以純凈水為提取溶劑，價廉易得，提取率高。目前，有關滇重樓中核苷類物質的藥用價值研究尚處于基礎階段，本研究優化的提取工藝可為重樓核苷化學物質組學和生物活性的深入研究和開發利用提供技術支持。

4 結論

優化得到滇重樓核苷類物質提取的最佳工藝條件：以純凈水（甲醇體積分數為0）為提取溶劑，在料液比1∶10、30 ℃條件下超聲波提取60 min，提取2次，得到滇重樓根莖中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷的總提取量為1.4216±0.0198 mg/g。該工藝操作簡便、穩定可靠，較熱水浸透法的提取效率高，適合用于滇重樓核苷的提取。

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（責任編輯 羅 麗）