流動注射化學發光測定頭孢類藥物研究

王偉　趙凱

摘要：分子發光光譜分析法中的化學發光分析法作為一種有效的分析方法，主要依據是檢測體系的化學發光強度與體系中待測物濃度在一定條件下將會呈現出線性定量關系的原理，并通過儀器對體系化學發光強度進行檢測，因此可確定待測物含量的一種分析方法。此分析方法具備設備簡單，線形范圍寬，靈敏度高等優點，與流動注射相結合將表現出精密程度高，容易實現自動化并且具有分析速度快等特點。文章對近些年頭孢類藥物的流動注射化學發光檢測進行了總結。

關鍵詞：化學發光法；流動注射；頭孢類藥物

化學發光分析法（ChemiLuminescence，CL）是根據化學反應過程當中產生的輻射光的強度來確定各種物質含量的分析方法，指的是某些化學反應過程中發出可見光的現象。其發光的反應機理是反應體系中的某些物質的分子吸收了反應所釋放出的能量而由基態躍遷到激發態，然后再由從激發態返回到基態，同時將能量以光輻射的形式釋放產生化學發光其過程可表示為A+B→C*+D，C*→C+hv或A+B→C*+D，C*+F→F*+c，F*→F+hv。將化學發光反應應用于分析化學當中，據某一時刻的發光強度或者反應的總發光量來確定整個體系當中的相對應組分含量的分析方法叫作化學發光分析法。該種方法雖然具有儀器簡單、線性范圍寬、靈敏度高并且不存在空白的優點，但化學發光現象出現時間短并且隨時間變化發光強度會有較大變化，而且受到環境因素的影響較大，導致反應進程很難控制，選擇性和重現性都較差，很難實現自動化等。流動注射技術卻可以彌補此法的不足之處，所以將流動注射技術與化學發光法有機地結合起來，集二者之優點，最終就可實現自動化，而且還能將化學發光信號的重現性顯著提高，因而，化學發光分析法成了一種靈敏、高效的痕量和超痕量分析技術。

目前，主要使用的化學發光反應體系有：（1）Ce（Ⅳ）—Rh6G：（2）高錳酸鉀；（3）磷鉬釩雜多酸—魯米諾；（4）Luminol—H₂O₂；（5）魯米諾—高錳酸鉀；（6）NBS—熒光素等。作為高效的痕量和微量分析方法，化學發光分析法有其獨特的優勢，在生命科學、醫學等領域中的應用前景都較為廣泛。本研究從對與生命相關物質以及目前各種藥物和藥物在人體中代謝產物的化學發光分析進行了簡要綜述。

1頭孢類藥物

頭孢類藥物屬于頭孢菌素類抗生素，微生物或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物即為抗生素。將微生物生物合成的抗生素為基礎，并對其結構進行改造，得到的具有新的抗菌活性的化合物即為半合成抗生素。頭孢類抗生素的共同結構如圖1所示。

頭孢菌素類抗生素有兩個不同的側鏈集團R₁與R₂，并且可以在這兩處引入不同的功能基團，因此可以合成一系列頭孢菌素；其中抗菌活性決定基團為R₁影響抗菌效率以及藥代動力學的性質的為R₂。近年來一直占抗生素類藥物首位的為頭孢菌素類抗生素。因此測定分析該種類藥物都有著極其重要的意義。在這些檢測方法中有高效液相色譜法、熒光法、吸附極譜法、化學發光法等。現對化學發光法進行綜述。

2測定頭孢類藥物常用的化學發光體系

2.1 Ce（IV）—Rh6G化學發光體系

試驗研究表明，Ce（Ⅳ）氧化含巰基（—SH）的化合物會產生弱發光，Rh6G也能夠大大增強此弱發光，據此建立了測定頭孢類—內酰胺類抗生素的FIA—CL分析方法。楊季冬等在選定的最佳條件下，經測試對頭孢拉定，硫酸鈰濃度為0.010 mol/L時化學發光強度為最大；而對頭孢哌酮，硫酸鈰濃度為0.005 mol/L時化學發光強度為最大，幾個典型的頭孢類抗生素化學發光強度均在1.0×10^-8～1.5×10^-5g/mL范圍內且與其發光強度呈良好的線性關系。

范順利等研究發現，在Na₅P₃O₁₀的增敏下，Ce（Ⅳ）與β—內酰胺菌素作用可產生較強的熒光性，而與某些含巰基的化合物作用則產生化學發光。Ce（Ⅳ）與頭孢氨芐直接作用沒有化學發光產生；但將頭孢氨芐預先水解再與Ce（Ⅳ）作用，因其水解產物1含有巰基，則可產生化學發光。經實驗證實了這一推測，并且發現羅丹明6G對該發光體系具有很強的增敏作用。研究還得到當羅丹明6G的濃度為1.0×10^-4mol/L，H₂SO₄濃度和加熱時間分別為1.6 mol/L，15 min，Ce（Ⅳ）與H₂O₄混合載液的流速為10 mL/min，載液HSO₄的濃度為0.3 mol/L，Ce（Ⅳ）的濃度為0.02 mol/L時為最佳試驗條件，在選定的最佳試驗條件下，測定發光強度k（相對發光強度單位）與頭孢氨芐質量濃度c（mg/L）在0.10～10.0 mg/L范圍內呈線性關系，其回歸方程Ia=0.33+1.59c（n=11，r=0.999 4）。對1.00 mg/L頭孢氨芐標準溶液進行了11次平行測定，相對標準偏差為0.8%，根據IUPAC的規定計算出該方法的檢出限為0.06 mg/L。

周杰等研究發現有一定的巰基存在頭孢他啶的降解產物當中，運用流動注射化學發光法考察了Ce（Ⅳ）與此降解產物作用而產生化學發光的條件，研究表明羅丹明6G對該體系有著較強的增敏作用，據此建立了測定頭孢他啶的新方法。研究發現當羅丹明6G濃度為5×10^-5，H₂SO₄濃度為1.6 mol/L、時間為10 min、硫酸鈰溶液濃度為0.02 mol/L、主泵速為30 r/min（硫酸鈰溶液）、副泵速為20 r/min（H2S04溶液）時為最佳試驗條件。對6.0mg/L頭孢他啶標準溶液進行10次平行測定，相對標準偏差為1.1%。根據3S/K，計算出該方法的檢出限為0.070 mg/L，試驗結果較滿意。

2.2 Mn（Ⅲ）化學發光反應體系

在強酸性介質中，基于初生態Mn（Ⅲ）直接氧化頭孢拉定產生強化學發光，將在線恒電流電解產生Mn（Ⅲ）與流動注射技術相結合，創建了流動注射電化學發光法測定頭孢拉定的新方法。陳小利等在優化的試驗條件下，發現MnSO₄濃度為0.2 mol/L，H₂SO₄的濃度約等于3.0 mol/L、電解電流為12.0 mA、流速為2.0 mL/min時電化學發光強度最大，在上述最佳的選定實驗條件下，頭孢拉定的電化學發光強度與其質量濃度在1 0×10^-7～5.0×10^-5g/mL范圍內有良好的線性關系。

2.3高錳酸鉀化學發光體系

在強酸性介質中，基于KMnO₄氧化頭孢類藥物能產生化學發光，采用流動注射技術，建立了頭孢類抗生素藥物的測定新方法。實驗表明在有甲醛存在的情況下，頭孢菌素類抗生素可直接被酸性KMnO₄氧化并產生強烈的化學發光，頭孢類抗生素的濃度與其發光強度呈良好的線性關系。并在HCl濃度為1.5 mol/L，HCHO體積分數6%，KMnO₄濃度為3.2×10^-4mol/L，進樣泵的泵速為20 r/min，載流泵的泵速為22 r/min，進樣體積為100 pL，光電倍增管—800V的試驗條件下，最終試驗表明，其發光強度與頭孢氨芐的質量濃度在0.8～25 g/mL范圍內呈良好的線性關系，頭孢拉定的線性范圍為0.8～2 g/mL。

2.4磷鉬釩雜多酸—魯米諾化學發光體系

瞿鵬等基于魯米諾在NaOH介質中，磷鉬釩雜多酸可將其氧化產生較強的化學發光，頭孢曲松鈉能夠強烈抑制其化學發光，據此建立了磷鉬釩雜多酸一魯米諾一頭孢曲松鈉化學發光抑制法測定頭孢曲松鈉的新體系，并結合流動注射分析技術測定藥品中的頭孢曲松鈉.在磷酸二氫鈉質量濃度為8.0×10^-6g/mL、釩酸鈉質量濃度為2.0×10^-6g/mL，H₂SO₄的濃度為0.01 mol/L，NaOH的濃度為0.1 mol/L，3.0 mL/min作為載流的流速時，相對化學發光強度與頭孢曲松鈉的質量濃度在4.0×10^-7～4.0×10^-5g/mL范圍內呈線性關系；此方法的檢出限為8×10^-8g/mL對8.0×10^-6g/mL的頭孢曲松鈉連續進行11次測定，相對標準偏差為2.8%。此方法已被成功地應用于頭孢曲松鈉藥品的測定。

2.5 Luminol—H₂O₂化學發光體系

武現麗等利用在堿性介質中，頭孢哌酮鈉對Luminol—H₂O₂化學發光體系有著較大的增強作用，建立了頭孢哌酮鈉流動注射化學發光測定法。武現麗等選擇0.01 mol/LNaOH溶液為反應介質、Luminol的濃度為2×10^-4～mol/L，H₂O₂的濃度為0.8mol/L為最佳試驗條件。在選定的最佳試驗條件下，頭孢哌酮鈉質量濃度在5.0×10^-7×4.0×10^-5g×mL范圍內，與發光強度增強值成良好的線性關系。

2.6魯米諾—高錳酸鉀發光體系

陳麒等研究表明孢氨芐抗生素在對魯米諾一高碘酸鉀化學發光反應中有很強的增敏作用，因此通過優化試驗條件，并構建了頭孢氨芐的流動注射化學發光分析法。他們在多次試驗中得到當氫氧化鈉的濃度為0.1 mol/L、魯米諾濃度為1.0×10^-4mol/L，KIO₄濃度為1.0×10^-5mol/L為最佳試驗條件，在此條件下得到檢出限為9×10^-10g/mL，線性范圍為1×10^-9g/mL～2×10^-7g/mL，相對標準偏差小于2%。此法用于頭孢氨芐膠囊中藥物含量的測定，結果較滿意。

王玨等研究發現，頭孢他啶對魯米諾一高錳酸鉀的體系有著明顯增敏作用，將納米金加入體系后，其增敏作用會顯著增強。通過運用流動注射化學發光法，在魯米諾一高錳酸鉀的發光體系中加入納米金，其體系的發光強度顯著增強，因此構建了測定頭孢他啶的新方法。研究表明當納米金粒徑為16 nm，NaOH的濃度為0.18 mol/L、納米金濃度為3.5×10^-5mol/L、高錳酸鉀濃度為6.0×10^-4mol/L、魯米諾的濃度為8.0×10^-4mol/L為試驗最佳條件。在最佳的試驗選定條件下，將同一個系列的不同濃度的頭孢他啶溶液進行分析測定。最終得出在加入納米金后，測得的頭孢他啶靈敏度更高、檢出限更低、線性范圍變寬。

2.7魯米諾—鐵氰化鉀發光體系

當前，臨床上醫學應用最廣泛的長效、第三代廣譜頭孢菌素類抗生素

是頭孢曲松鈉，所以測定對其藥物制劑的測定分析對于臨床用藥安全合理性都有著重要的意義。試驗發現，基于在堿性介質中頭孢曲松鈉對魯米諾—鐵氰化鉀化學發光體系都有著較強的增強作用，據此建立了流動注射化學發光測定頭孢曲松鈉的新方法。經過試驗研究得知，當魯米諾濃度為8×10^-4mol/L，K₃Fe（CN）₆溶液濃度為4.0×10^-4mol/L，NaOH濃度為0.20 mol/L時為最佳試驗條件，在選定的最佳條件下，得到該方法的測定范圍為0.1～400 mg/L，檢出限為0.06 mg/L.對0.2 mg/LCRO溶液進行10次平行測定，相對標準偏差為1.6%。

2.8 NBS—熒光素化學發光體系

張淑瓊研究在氫表明在氧化鈉介質中，鹽酸頭孢吡肟可以被N一溴代琥珀酰亞胺（NBS）氧化并產生微弱的化學發光，在與熒光素共存的狀態下可產生較強的化學發光，因此結合流動注射技術，可建立測定鹽酸頭孢吡肟的流動注射化學發光方法。研究發現，當熒光素濃度為3 mmol/L、氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L、NBS濃度為0.025 mol/L時為最佳試驗條件，在最佳的試驗選定條件下，發光強度與鹽酸頭孢吡肟質量濃度在0.05 mg/L～10 mg/L范圍內呈良好的線性關系。其線性方程ΔI=147.34 c+5.741 3（c：mg/L，R₂=0.999 9）。對5.000 mg/L鹽酸頭孢吡肟連續平行測定11次，相對準標準偏差（Relative Quasi Standard Deviation，RSD）為43%。

何樹華等研究表明頭孢吡肟和頭孢克肟在堿性的介質中被NBS（N一溴代琥珀酰亞胺）氧化后，其產生的能量可激發共存的熒光素，從而產生化學發光，據此建立了一種直接測定頭孢吡肟與頭孢克肟的化學發光方法。研究表明，當熒光素濃度超過4.0 mmol/L，NaOH濃度為0.05 mol/L，NBS的最佳濃度均為0.03 mol/L為最佳試驗條件，在最佳試驗條件下，對鹽酸頭孢吡肟和頭孢克肟進行測定，對5 mg/L的頭孢吡肟平行測定11次，其RSD為2.5%。根據IUPAC建議，計算得檢出限為5.7 g/L；對0.5 mg/L的頭孢克肟平行測定11次，其RSD為2.9%，計算得檢出限為0.048 mg/L。

3展望

化學發光分析法因為其儀器設備簡單、靈敏度高，并且可以與其他技術的聯合使用，所以應用范圍會不斷擴大，特別是在環境監測分析與免疫分析上會有更加廣泛的應用。當前開發簡便經濟且具有高發光率的新發光試劑仍是重點研究方向。這種分析方法因其具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單等獨特的優勢而普遍被人們所接受并重視。伴隨著各種新的化學發光體系的不斷涌現，一定會完善和豐富原有的化學發光體系，使得化學發光分析法的應用更加廣泛，尤其是與CE，HPLC等方法聯用對各種藥物進行檢測分析，更凸顯其潛在的優勢，作為分析化學較為活躍的新發展領域。

4結語

作為一種有效的分析測試手段，化學發光分析法具有廣泛的應用前景，從藥物的測試分析來看，伴隨著人們健康水平不斷地提高，人們對于用藥的安全合理性、有效性提出了更高的要求，特別是藥物在人體內不斷地變化，從而直接影響）2t門對這種藥物的評價，所以化學發光分析將會在藥物測試分析中有著更廣闊的應用，然而還可以作如下改進：（1）若使化學發光分析法能更廣泛地應用于藥物的測試分析，則需要通過大量的實驗和反復考查論證才能夠被廣泛地接受，而且通過大量的普及與推廣，才能不斷地完善和發展化學發光分析法。（2）化學發光分析方法儀器設備簡單，易于操作和推廣，憑借它獨特的優勢，在未來的幾年間在基層藥事業單位普及化學發光分析方法，對合理安全用藥會起到很大幫助，也會產生不同的經濟和社會效益。