響應面分析法優化紅小豆分離蛋白的提取工藝

宋龍淵　王靜　鄧小蓉　張正紅　雷用東

摘要[目的]采用響應面分析法優化紅小豆分離蛋白的提取工藝。[方法]在單因素試驗的基礎上，選取因素與水平，根據中心組合試驗Box-Behnken設計原理采用4因素3水平的響應面分析法，優化紅小豆分離蛋白的提取工藝。[結果]各因素對豆粉分離蛋白提取率的影響順序從大到小為pH、固液比、溫度、時間；通過經典分析確定豆粉分離蛋白最佳提取工藝：pH 9.0，溫度為45 ℃，固液比為1∶20，時間為60 min。在該條件下，豆粉分離蛋白提取率理論值為81.3%，實際紅小豆分離蛋白提取率為（24.3±2.0）%。[結論]響應面分析法用于優化紅小豆分離蛋白的提取工藝可行，建立的數學模型與試驗數據相符，可為紅小豆的綜合開發利用提供理論依據。

關鍵詞紅小豆；分離蛋白；提取率；響應面分析

中圖分類號S521文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）31-0004-04

Abstract[Objective]The aim was to optimize the extraction process for isolate protein from red adzuki bean by response surface methodology.[Method]We selected the factors and levels on the basis of single factor experiment， and designed the experiment with 4 factors and 3 levels based on the principle of BoxBehnkens design to optimize the extraction process for isolate protein from red adzuki bean.[Result]The effect of the factors of extraction pH， solidliquid ratio， temperature and time on extraction ratio was in decreasing sequence.The optimal extraction technology obtained through the classical analysis was as followed： pH for 9.0， extraction temperature at 45 ℃， the ratio of solid to liquid being 1∶20 and extraction for 60 min.Under this condition， the theoretical value of the extraction rate of soybean powder isolate protein was 81.3%， and the actual extraction rate of for isolate protein from red adzuki bean was（24.3±2.0）%.[Conclusion]The obtained values agree with the predicted values of the mathematic models， and the BoxBehnken experimental design is suitable for optimizing the extraction of the isolate protein from red adzuki bean powder， which could provide scientific basis for the comprehensive development and utilization of red beans.

Key wordsRed adzuki bean；Isolate protein；Extraction rate；Response surface methodology

紅小豆（Vigna umbellata），即赤小豆，又名赤豆、蛋白豆、赤山豆，是豆科植物，外形與紅豆相似而稍微細長[1]。紅小豆是我國食用豆類之一，其蛋白質平均含量為22.65%，比禾谷類蛋白質含量高2～3倍，現作為經濟作物在全國各地普遍栽培。紅小豆是一種高蛋白、低脂肪、多營養的功能食品，具有清熱解毒、消積化瘀等療效，是日常生活必備的家用食材[2-4]。經查閱國內外相關文獻[5-7]，目前尚無較好的紅小豆分離蛋白提取工藝。為此，筆者采用單因素試驗結合星點設計一效應面法優化紅小豆分離蛋白的提取工藝，同時利用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗模型進行典型性分析[8]，確定紅小豆分離蛋白的最佳提取工藝，為紅小豆分離蛋白的后續開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料紅小豆購自新疆石河子市金馬農貿市場。試劑：石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、甲基紅-溴甲酚綠，均為分析純；實驗室用水均為去離子水。儀器：紫外可見分光光度計（721型，上海第三分析儀器廠）、pH計（pH S-3C型，上海精密科學儀器公司）、凱式定氮儀（SKD-800型，上海沛歐分析儀器公司）、高速冷凍離心機（Neofuge15R型，上海力康公司）、高速粉碎機（MK-200型，南京威利朗公司）、真空冷凍干燥機（LG-1.0型，沈陽航天新陽公司）、大容量離心機（LXJ-ⅡB型，上海安亭科學儀器廠）、恒溫水浴鍋（HSQ-3型，上海智域分析儀器制造公司）、電子天平和磁力攪拌機。

1.2方法

1.2.1單因素試驗。

1.2.1.1原料預處理。稱取1 kg樣品，浸泡雜質，干燥12 h，粉碎3次，石油醚浸泡3 h去除油脂后，晾干，獲得豆粉備用。

1.2.1.2分離蛋白提取。設計pH、溫度、時間和固液比4個單因素提取條件，研究提取條件對分離蛋白提取率的影響。稱取10 g預處理后的豆粉，經不同PBS緩沖液（固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、不同pH（8.0、8.5、90、95和10.0）、不同攪拌提取時間（30、40、50、60和70 min）和不同溫度（35、40、45、50和55 ℃）提取后，在4 ℃下4 000 r/min離心15 min取上清液棄沉淀，用0.1 mol/L HCl調節上清液的pH到等電點pI 4.0，繼續離心15 min，棄上清取沉淀，用蒸餾水重復洗滌2～3次，經真空冷凍干燥得到分離蛋白，得到干燥物后測定溶液蛋白質含量及確定最佳提取條件。

1.2.2響應面分析法優化提取。

以蛋白提取率為響應值，采用Design-Expert 8.0.5軟件，應用響應面分析法，選用Box-Behnken通過試驗數據擬合響應面模型，對單因素試驗結果進行響應面試驗，研究工藝條件對提取效果的影響，確定最佳工藝路線。

選用Factors=4，Runs=29的中心組合設計，通過試驗數據擬合響應面模型，確定試驗運行順序，進行試驗并收集數據，分析試驗數據，優化因素的設置水平，最終確定最佳提取條件。

1.2.3分離蛋白含量測定。

參照GB 5009.5—2016食品中蛋白質的測定第一法凱氏定氮法，測定其紅小豆分離蛋白的含量[9]。3次重復，同時做空白試驗。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

由圖1可知，pH<9.0時，隨著pH的增加，蛋白質提取率明顯上升；pH>9.0時，蛋白質提取率有所下降，可能是由于堿性的增強，部分改變的蛋白質分子表面的帶電情況增加了部分蛋白質的水溶性，在酸沉時造成部分蛋白質的損失；同時當堿性過強時，容易發生蛋白質脫氨、脫羧等，引起胱賴反應產生有毒物質，同時還會產生異味，造成蛋白質的損失，因而蛋白質提取率降低[10]。由圖2可知，提取溫度方面，當低于45 ℃時，蛋白質提取率隨著溫度的升高而增加；當高于45 ℃時，蛋白質提取率有所下降。可能是隨著溫度的升高，蛋白質結構發生變化或者部分蛋白質變性，導致提取率下降。

由圖3可知，提取時間方面，小于60 min時，提取率隨時間的延長而增加，變化比較明顯；當大于60 min時，蛋白質的溶出率變化不大，所以蛋白質提取率基本沒有變化。由圖4可知，固液比方面，隨著固液比的增大，蛋白質提取率不斷增加，因為在低的固液比環境下，料液體系分散不均勻，不利于蛋白質的充分溶解，所以此時蛋白質提取率較低；當固液比增加到1∶20時，蛋白質提取率增加并不明顯。綜合上述結果，提取合適條件為：pH 8.5～9.0，提取溫度40～45 ℃，提取時間60～70 min，固液比1∶25～1∶20。

2.2響應面分析法優化提取

2.2.1響應面分析因素水平的選取。通過單因素試驗，得到每個單因素的相對合適的條件，在此基礎上對影響蛋白質提取率的單因素固液比、pH、溫度、時間進行4因素3水平的響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

安徽農業科學2017年

2.2.2響應面分析實驗設計方案。

以提取pH、溫度、時間、固液比為自變量，以紅小豆蛋白質提取率為響應值，進行響應面分析試驗，結果見表2。

對該模型進行方差分析。結果表明，回歸決定系數（R2）為0.845 2，修正決定系數（Adj R-Squared）為0.690 4，說明該模型能解釋0.690 4的變化，矢擬項不顯著（P>0.05），表明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用該模型對紅小豆分離蛋白提取試驗進行分析和預測。通過直接比較方程中一次項系數絕對值大小來判斷因素影響的主次性，對紅小豆中蛋白質提取率的影響因素從大到小依次是pH、固液比、溫度、時間。

2.2.4響應面分析法分析各因素間的相互作用結果。

利用響應面分析pH、溫度、時間和固液比各因素之間的相互作用。

由圖5可知，提取時間和pH對蛋白質提取率都顯示出二次效應，隨著兩者的增加，蛋白質提取率均呈現先增加后減少的趨勢，說明兩者的交互作用對蛋白質提取率影響顯著。

由圖6可知，提取溫度和pH對紅小豆蛋白質提取率都顯示出二次影響，隨著溫度的升高，提取率呈現先增加后減少的趨勢，而隨著pH的增加，蛋白質提取率呈上升趨勢，說明兩者的交互作用對蛋白質的提取率均有影響。

由圖7可知，固液比和pH對蛋白質提取率都顯示二次效應，隨著兩者的增加，蛋白質提取率均呈現先增加后減少的趨勢，說明兩者的交互作用對蛋白質提取率影響顯著。

由圖8可知，提取溫度和時間對蛋白質提取率都顯示出二次影響，而且曲面的坡度比較陡，說明二者之間的交互作用對蛋白質提取率的影響特別顯著。

由圖9可知，提取時間對蛋白質提取無顯著影響，但是隨著固液比的增加，蛋白質提取率呈現先上升后下降的趨勢。

由圖10可知，固液比和溫度對蛋白質提取率的影響都顯示出二次影響，而且曲面的坡度比較陡，說明二者之間的交互作用對蛋白質提取率的影響特別顯著。

綜合分析，固液比、pH和溫度變化時，響應值變化較大，表現為曲線較陡。pH、固液比和溫度對提取率的影響較顯

著，提取時間影響不大。

2.2.5最優條件的確定及驗證。

利用Design-Expert軟件對模型進行進一步分析，以獲得最優的提取條件。經分析得最佳的提取條件：pH 9.0，固液比1∶20，溫度45 ℃，時間60 min。在上述條件下，豆粉蛋白質提取率的理論預測值為813%。在最佳的提取條件下進行3次重復試驗，蛋白質提取率達79.3%，與理論值相差2百分點。由此可見，響應面分析的優化結果與實際值較吻合，得到的提取工藝條件具有一定的應用價值。

3結論

紅小豆分離蛋白在提取固液比為1∶20、pH為9.0、溫度為45 ℃、時間為60 min的條件下，提取率較高，通過計算，10 g豆粉含蛋白質7.93 g，分離蛋白提取率達79.3%，原料預處理損失系數為3.3，最終原始紅小豆樣品分離蛋白提取率為（24.3±2.0）%。該法的回收率高，重現性好，方法簡單，適用于紅小豆分離蛋白提取的質量控制。該研究采用響應面法優選紅小豆分離蛋白的提取工藝，最終確定了其最佳提取條件。在最佳條件下，實測值與預測值比較吻合，相對偏差較小，為響應面法應用于中藥及食品提取工藝的優化提供了理論依據。

參考文獻

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