酸性土壤改良劑與生防制劑協同防控香蕉枯萎病的效果

黃建鳳 張發寶 逄玉萬 黃巧義 付弘婷 李蘋 楊苞梅 唐拴虎

摘 要 將酸性土壤改良劑分別與生防制劑結合，通過溫室盆栽試驗研究其防控香蕉枯萎病的效果。酸性土壤改良劑分別與放線菌菌劑處理（ActA）和生物有機肥處理（BIOA）的協同防效（61.1%和58.3%）均高于單獨施用酸性土壤改良劑（ASA）（49.7%）、放線菌菌劑（Act）（55.6%）和生物有機肥（BIO）的處理（52.8%）。至試驗結束時，各處理土壤的pH值顯著高于對照（CK）（p<0.05）；Act和BIO處理顯著降低了香蕉根際尖孢鐮刀菌數量（p<0.05）；ActA和BIOA處理能顯著提高香蕉根際細菌和放線菌數量并降低真菌數量。各處理顯著促進香蕉生長，且能提高土壤有機質、有機碳、全氮、速效鉀含量和電導率。結果表明，酸性土壤改良劑和生防制劑可有效協同防控香蕉枯萎病。

關鍵詞 香蕉枯萎病；生物防控；酸性土壤改良劑；生物有機肥；放線菌菌劑

中圖分類號 S436.67 文獻標識碼 A

Abstract Fusarium wilt of banana is a lethality soil-borne disease and it is very important to control the threaten. Biocontrol efficacy on Fusarium wilt of banana was evaluated in this study based on greenhouse condition and physiological and biochemical analyzation， and the biocontrol materials were acid soil ameliorant collaborated with bioorganic fertilizer and actinomycetes agents. The results were listed as follows： treatments of collaborative of acid soil ameliorant and biocontrol materials（ActA and BIOA）showed higher biocontrol efficacy（61.1% and 58.3%）than those of Act（55.6%）and BIO（52.8%）， respectively. The soil pH value of ASA， Act， BIO， ActA and BIOA increased to some degree， and significantly higher than that of CK（5.13）（p<0.05）at the end of experiment（56 days after transplanting）. Application of biocontrol materials could significantly reduce the population of F. oxysporum in banana rhizosphere soil（p<0.05）and the collaborative of acid soil ameliorant strengthened this effect. Treatments ActA and BIOA could also significantly increase bacteria population， while decrease fungi population. Compared with CK， the stem diameter， length and biomass of banana plant in all treatments increased significantly and the organic matter， organic carbon， total nitrogen， available potassium and electric conductivity also increased.

Key words Fusarium wilt of banana； biological control； acid soil ameliorant； bioorganic fertilizer； actinomycetes agents

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.025

香蕉枯萎?。‵usarium oxysporum f. sp. cubense）又名香蕉巴拿馬病和黃葉病，是由古巴尖孢鐮刀菌侵染引起的一種由土壤和苗木傳播的毀滅性土傳真菌病害，該病害的防控已迫在眉睫。目前植物病害的生物防控因其環境友好型等特征已成為研究熱點。國內外已有很多研究者篩選到如非致病性尖孢鐮刀菌、木霉、放線菌、芽孢桿菌和假單胞菌等有益微生物，這些微生物均表現出一定的生防效果[1-3]。為保障拮抗菌在植株根際定殖，將有機載體與生防菌結合應用是一項有效措施。已報道的載體包括有機液肥、香蕉莖稈和動物糞便堆肥產品、菜粕堆肥和氨基酸有機肥等；與拮抗菌的結合方式有吸附和二次發酵，兩種方式獲得的產品在防效上存在差異，后者效果更好[4-7]。

長期連作香蕉的土壤易出現土壤酸化嚴重、植株營養失衡和枯萎病流行嚴重的現象[8]。有研究表明，連作土壤環境因子中，土壤pH值對尖孢鐮刀菌在土壤中增殖的影響非常顯著，隨著酸化程度的增加，尖孢鐮刀菌增殖速率顯著增加，因此，土壤酸化可能是造成連作枯萎病高發的重要原因[9-10]。針對蕉園土壤酸化的改良措施已有報道，主要是施用石灰、木薯渣、蔗渣、硝態氮肥、鈣、鐵、磷礦粉和堿性肥料等，這些措施均表現出一定的防效，其中堿性肥料的應用更是將香蕉枯萎病田間發病率降至18%以下，表明通過提高蕉園土壤pH值防控枯萎病危害的思路是可行的[11-13]。本研究將在前人基礎上，將蕉園酸性土壤改良作為防控香蕉枯萎病的措施之一，通過施用本研究室研制的酸性土壤改良劑改善土壤pH值，研究枯萎病防控效果。

綜上所述，為有效防控香蕉枯萎病發生，需從降低土壤酸化和抑制病原菌入侵兩方面著手，但已有的報道大多僅關注其中一個方面，有關兩者結合協同防控香蕉枯萎病的研究鮮有報道。因此，本研究選用生物有機肥和放線菌菌劑作為生防材料分別與酸性土壤改良劑結合，研究兩者協同防控香蕉枯萎病的效果，以期為蕉園土壤改良和病害防控提供新的綜合措施和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試生防材料包括：生物有機肥為“馕播王”復合微生物肥料（BIO）（總養分6%，有效活菌數≥0.2×108 CFU/g）（江蘇省江陰市聯業生物科技有限公司）和放線菌菌劑（Act）（粉劑，活菌數為2.0×1010 CFU/g）。酸性土壤改良劑（ASA）由本研究室研制，顆粒狀。供試香蕉苗品種為巴西蕉，無毒苗；枯萎病病原菌菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense為4號生理小種，兩者均由廣東省農業科學院果樹研究所提供。供試土壤為發病蕉園病原土，采自廣東省廣州市南沙區某蕉園，尖孢鐮刀菌數量經Komada H選擇性培養基[14]檢測，數量為107 CFU/g干土。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 盆栽試驗于2015年7月至9月在廣東省農業科學院農業資源與環境研究所溫室進行。試驗用病原土經充分混勻后，與適量健康土混合，用病原菌孢子液調節土壤尖孢鐮刀菌初始含量至105 CFU/g干土，每盆裝15 kg土。試驗共設7個處理：（1）CK：病原土，不施用生防制劑和酸性土壤改良劑，即化肥處理（尿素，磷酸二銨和硫酸鉀，各處理氮磷鉀肥按尿素4.26 g/15 kg土，磷酸二銨1.30 g/15 kg土，硫酸鉀2.62 g/15 kg土；（2）ASA：病原土，添加酸性土壤改良劑（0.5%土重）；（3）Act：病原土，添加放線菌菌劑（0.5%土重）；（4）BIO：病原土，添加生物有機肥（0.5%土重）；（5）ActA：病原土，添加酸性土壤改良劑（0.5%土重）和放線菌菌劑（0.5%土重）；（6）BIOA：病原土，添加酸性土壤改良劑（0.5%土重）和生物有機肥（0.5%土重）；（7）CK0：以從未種植過香蕉的健康土作為種植土壤，作為陰性對照。每處理10盆，每盆種植1株苗，所用蕉苗已長至6片葉，共70盆。移苗之前，將酸性土壤改良劑、生防制劑及兩者的混合物與土壤充分混勻。各處理養分用化肥補齊以保持一致，常規水分管理。

1.2.2 測定指標及方法 移苗完成后，每天記錄香蕉發病情況，待對照處理發病率達80%以上時結束試驗。香蕉發病指數分級為：0級為健康，1級為1%～25%葉片出現萎蔫，2級為26%～50%葉片萎蔫，3級為51%～75%葉片萎蔫，4級為75%以上葉片萎蔫或全株死亡。發病率的計算公式為：發病率（DI）=[∑（發病指數×該級別指數的植株數量）/（總植株數×最高級別發病指數）]×100%。生防率計算公式為：生防率=[（對照發病率-處理發病率）/對照發病率]×100%。

至試驗結束時，測定香蕉植株生長情況：用皮尺測量植株莖粗和株高后將整株香蕉苗取出，將根系上黏附的土壤用自來水洗凈，吸水紙吸干表面水分后稱量植株鮮重，之后裝入袋中放入烘箱于105 ℃下殺青15 min后70 ℃烘至恒重，稱重，每個處理3個重復。

微生物計數：取整株香蕉苗時，抖落根系上黏附的土壤，取1～2 g根系裝入自封袋中，并放入冰盒保存，每個處理取3個重復。樣品帶回實驗室后，稱取1 g根系至9 mL無菌水中，用斡旋儀充分震蕩混勻樣品，采用連續稀釋涂布法對根際土中的細菌、真菌、放線菌和病原菌數量進行計數，所用培養基分別為牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基、高氏1號和Komada H選擇性培養基。

土壤樣品理化性質測定：測定指標包括有機質、有機碳、全氮、有效磷、速效鉀和電導率，測定方法參照《土壤農化分析》進行。

1.3 數據分析

數據統計和分析軟件為Excel 2007和SigmaPlot 12.5。

2 結果與分析

2.1 不同處理對香蕉枯萎病的防控效果

添加生防制劑及與ASA配施均顯著降低了香蕉植株的發病率（圖1）。試驗持續56 d，至試驗結束時，CK0處理未出現發病癥狀；對照發病率高達90%，放線菌與ASA協同防控處理的發病率最低，為35.0%，經統計生防率達61.1%；其次為生物有機肥與ASA協同防控處理，生防率達58.3%；單施酸性土壤改良劑、放線菌菌劑和生物有機肥處理的發病率均高于與ASA協同處理，分別為45.1%、39.6%和42.4%。試驗表明，添加ASA能促進生防制劑更好的發揮生防效果，可能因為ASA可調節提高土壤pH值，使其往不利于病原菌生長而利于生防制劑生長的方向發展。

2.2 不同處理對根際土壤pH值的影響

各處理香蕉根際土壤pH值均顯著高于對照（p<0.05）（圖2）。處理土壤初始pH值為5.47，試驗結束時，對照pH值下降至5.13，而其余處理均有所上升，上升幅度最小的為Act處理，pH值為5.57，與ASA協同處理后，ActA處理的pH值為最高值5.99。處理BIOA的土壤pH值亦高于BIO處理，前者為5.78，后者為5.66。表明，生防制劑能改善土壤pH值，使其有所提高，不利于病原菌的生長，進而影響發揮生防效果。添加ASA協同防控處理能更好更顯著的提高土壤pH值，為提高生防率奠定基礎。

2.3 不同處理對根際病原菌數量的影響

添加生防制劑及與ASA協同防控均顯著降低根際土壤中病原菌的數量（圖3），試驗結束時，對照根際病原菌數量達7.46 lg CFU/g干土。協同防控處理ActA和BIOA的根際病原菌數量低于單施處理Act和BIO以及ASA處理，5個處理中數量最高的是BIO處理，為4.79 lg CFU/g干土，最低數量為ActA處理的4.06 lg CFU/g干土。表明，生物有機肥和放線菌菌劑中富含的具有抑菌作用的功能菌株能有效抑制香蕉根際病原菌的生長，添加ASA后效果增強，表明通過調節改善土壤酸性條件，可促進生防制劑更好的發揮防控效果。

2.4 不同處理對根際微生物數量的影響

與對照相比，各處理均能顯著提高根際細菌和放線菌數量，而降低真菌數量（圖4）。至試驗結束時，對照根際細菌數量為6.51 lg CFU/g干土，顯著低于CK0（7.49 lg CFU/g干土）（p<0.05），其余處理中最低值為處理Act的7.85 lg CFU/g干土，最高值為處理BIOA的8.04 lg CFU/g干土，協同處理BIOA和ActA的根際細菌數量均高于單施處理BIO和Act，但差異不顯著（圖4-A）。細菌是土壤微生物中數量最多的類群，其數量變化可在一定程度上反映出土壤微生物多樣性的變化。各處理能顯著提高根際細菌數量，表明土壤微生物多樣性提高，使土壤微生物群落往“健康”方向發展。添加ASA協同作用效果更佳，表明通過調節提高土壤pH值，可使其有利于細菌生長，從而在一定程度上不僅促進功能菌的定殖，也有利于細菌的繁殖。

處理中真菌數量最高的為BIO處理，值為4.00 lg CFU/g干土，但仍顯著低于對照5.07 lg CFU/g干土（p<0.05）（圖4-B）。除CK0外，5個處理中作用最顯著的為ActA處理，該處理真菌數量低至3.55 lg CFU/g干土，與對照相比降低了30.0%；其次為BIOA處理，該處理數量高于ActA，但兩者不存在顯著差異。土傳病害病原菌多為真菌，根際真菌數量減少表明各處理功能菌能顯著抑制病原真菌生長，從而降低真菌數量。添加ASA后，土壤酸性條件得到改善，pH值上升，有利于土壤中細菌和放線菌的生長繁殖而不利于喜酸真菌的生長，使其繁殖受限，進而數量下降。

各處理顯著提高了香蕉根際放線菌的數量（p<0.05）（圖4-C），其中作用效果較強的為Act和ActA處理，兩者處理根際放線菌數量分別為5.91 lg CFU/g干土和6.02 lg CFU/g干土，與對照相比分別增加了21.6%和23.9%。BIO和BIOA處理效果稍弱，根際放線菌數量分別為5.32 lg CFU/g干土和5.65 lg CFU/g干土，分別較對照增加了9.4%和16.3%。與上述4個處理相比，單施ASA處理根際放線菌數量最低，為5.65 lg CFU/g干土。Act和ActA處理富含放線菌，有利于增加土壤放線菌數量，這些菌株可代謝產生多種抑菌抗生素，菌株數量的增加表明抗生素產量的增加，有利于抑制病原菌的繁殖，使土壤根際微生物群落向健康方向發展。

2.5 不同處理對香蕉生長的影響

與對照相比，各處理顯著提高了香蕉植株的株高和莖粗（p<0.05），植株鮮重和干重均有所增加（表1）。除CK0外，處理BIOA的株高和莖粗增加幅度最大，分別比對照增加了46.8%和13.4%；株高增幅最小的處理為Act，增長了32.9%，而莖粗增幅最小的處理為BIO，增長9.7%。在生物量方面，BIOA處理增加效果最顯著，鮮重和干重增幅分別為33.3%和42.9%；BIOA和ActA對植株干重的影響顯著高于相應的ASA、BIO和Act處理（p<0.05）。表明，生防制劑的添加可能抑制了病菌的生長，減少其入侵植株根系，從而保障植株正常生長。添加生物有機肥比放線菌菌劑更好的提高植株生物量，可能由于生物有機肥中含有有機載體，可為香蕉生長提供養分，而放線菌菌劑養分含量則較少，因此促生效果較弱。

2.6 不同處理對土壤理化性質的影響

CK0對照土壤各項理化性質均低于其他處理（表2），且除有效磷之外，其余各項指標差異均達顯著水平（p<0.05）。處理ASA、BIO、Act、ActA和BIOA土壤的有機質、有機碳、速效鉀和電導率均高于對照CK，表明生防制劑可有效調節提高土壤養分；但全氮含量與CK差異較小，僅BIOA與CK存在顯著差異；而土壤有效磷含量方面，BIOA處理顯著低于CK。雖然CK0處理土壤養分含量較低，但由表1可知，CK0處理植株生物量高于其他處理，可能由于CK0為化肥處理，養分較易被植株吸收，有利于植株生長，在整個試驗過程中沒有追肥措施，至試驗結束時，土壤中的養分可能已被植株大量利用，使得殘留養分較少；而處理BIO、Act、ActA和BIOA中含有有機載體，其中含有的養分釋放較慢，可持續供給植株，但這些處理的植株由于受病原菌威脅，可能影響了植株生長。

3 討論

生防制劑與酸性土壤改良劑能協同防控香蕉枯萎病，這一綜合防控措施的生防效率高于單獨施用生防制劑的效果，且有利于改善香蕉根際微生物多樣性。與酸性土壤改良劑協同應用的生防制劑中即分別含有生防細菌和放線菌，酸性土壤的改良不僅有利于提高土著細菌和放線菌的數量，更為兩種功能微生物提供了有利的活動場所，使其更有效的發揮生防作用。酸性土壤改良劑的應用可有效提高土壤pH值，使其顯著高于對照，土壤酸性有中和趨勢。本研究應用的酸性土壤改良劑偏堿性且富含有效鈣和磷的無機礦物質，能有效提高土壤pH值，降低土壤中交換性H+和交換性Al3+的含量，是農業生產中改良反酸田的適宜改良劑[15]。有研究表明，土壤pH值的升高與病害發生呈顯著的負相關關系；而在香蕉移栽前添加石灰等改良劑中和土壤酸性有利于破壞香蕉枯萎病發病條件而防控病害發生[13，16]。有關香蕉根際酸性土壤改良能防控枯萎病發生的機理已有報道，香蕉枯萎病病原菌是喜酸真菌，酸性土壤改良劑的改良效果使得香蕉枯萎病菌逐漸失去最適土壤環境，而偏中性的土壤環境有利于細菌或放線菌等有益微生物的活動和繁殖，從而改善土壤微生物的多樣性，進而對香蕉枯萎病產生一定的防控作用[10，17-18]。此外，本研究應用的微生物有機肥包含有效的有機載體，總養分含量為6%，有利于其中含有的功能細菌在土壤中存活，拮抗菌在有機肥協助下形成“基質-菌群”生態系統，可改變香蕉根際土壤微生物生態特征和物理化學特性，有利于調節土壤微生態環境，降低病原菌數量，從而起到防病作用[19-21]。有田間試驗表明，連續施用生物有機肥能優化連作蕉園土壤微生物群落多樣性，防控香蕉枯萎病的發生，提高香蕉產量并改善果實品質[22-24]。本研究應用的另一種生防制劑為放線菌菌劑，該產品由放線菌和發酵載體組成。放線菌作為生防菌株應用于土傳病害防控已有很多報道，在黃瓜和香蕉枯萎病防控上均有研究[1，25-26]，表明放線菌用于生物防控具有極大潛力。

綜上所述，酸性土壤改良劑與生防制劑協同應用的綜合措施有利于提高防效。初步研究表明該作用的機理在于：酸性土壤改良劑可提高香蕉根際土壤pH值，使其不利于病原真菌生長，從而降低根際土壤病原菌數量，而偏中性環境有利于細菌和放線菌生長，可保障生防制劑中的拮抗細菌和放線菌的生存和繁殖，從而提高兩者在土壤中的數量，進而促進生防制劑更有效的發揮防控效果。有關這兩者在田間對香蕉枯萎病的協同防控效果還有待進一步驗證。

參考文獻

[1] 張桂興， 王樹桐， 方 哲， 等. 香蕉鐮刀菌枯萎病拮抗放線菌的篩選及菌株Da03047的鑒定[J]. 中國生物防治， 2007（1）： 32-36.

[2] 胡 偉， 趙蘭鳳， 張 亮， 等. 香蕉枯萎病生防菌AF11的鑒定及其定殖研究[J]. 中國生物防治學報， 2012， 28（3）： 387-393.

[3] Bancy Waweru， Losenge Turoop， Esther Kahangi， et al. Non-pathogenic Fusarium oxysporum endophytes provide field control of nematodes， improving yield of banana （Musa sp.）[J]. Biological Control， 2014， 74： 82-88.

[4] 孫正祥， 紀春艷， 李云鋒， 等. 香蕉枯萎病拮抗細菌的分離篩選與鑒定[J]. 中國生物防治， 2008（24）： 143-147.

[5] 何 欣， 郝文雅， 楊興明， 等. 生物有機肥對香蕉植株生長和香蕉枯萎病防治的研究[J]. 植物營養與肥料學報， 2010， 16（4）： 978-985.

[6] 鄧小墾， 董存明， 張彥龍， 等. 生豬糞與香蕉莖桿高溫堆肥的研究[J]. 南京農業大學學報， 2014， 37 （3）： 83-87.

[7] Zhang N， He X， Zhang J， et al. Suppression of Fusarium Wilt of banana with application of bio-organic fertilizers[J]. Pedosphere， 2014， 24： 613-624.

[8] 熊柳梅， 周柳強， 謝如林， 等. 香蕉地土壤pH的空間變異及其對土壤速效鉀的影響[J]. 廣西農業科學， 2006（1）： 40-43.

[9] 彭 雙， 王一明， 葉旭紅， 等. 土壤環境因素對致病性尖孢鐮刀菌生長的影響[J]. 土壤， 2014， 46（5）： 845-850.

[10] 姚燕來， 黃飛龍， 薛智勇， 等. 土壤環境因子對土壤中黃瓜枯萎病致病菌增殖的影響[J]. 中國土壤與肥料， 2015 （1）： 106-110.

[11] 吳家華， 劉寶山， 董云中， 等. 粉煤灰改土效應研究[J]. 土壤學報， 1995， 32 （3）： 334-340.

[12] 牛花朋， 李勝榮， 申俊峰， 等. 粉煤灰與若干有機固體廢棄物配施改良土壤的研究進展[J]. 地球與環境， 2006， 234： 27-34.

[13] 樊小林， 李 進. 堿性肥料調節香蕉園土壤酸度及防控香蕉枯萎病的效果[J]. 植物營養與肥料學報， 2014， 20（4）： 938-946.

[14] Komada H. Development of selective medium for quantitative isolation of Fusarium oxysporum from natural soil[J]. Rev Plant Prot Res， 1975， 8： 114-125.

[15] 易 瓊， 楊少海， 黃巧義， 等. 改良劑對反酸田土壤性質與水稻產量的影響[J]. 土壤學報， 2014， 51（1）： 176-183.

[16] 郭水木， 楊志明. 香蕉鐮刀菌枯萎病的發生規律與綜防措施[J]. 現代園藝， 2009（2）： 31-32.

[17] 胡莉莉， 竇美安， 謝江輝， 等. 香蕉枯萎病抗病性研究進展[J]. 廣西熱帶農業， 2006（1）： 16-18.

[18] 王世強， 胡長玉， 程東華， 等. 調節茶園土壤pH對其土著微生物區系及生理群的影響[J]. 土壤， 2011（1）： 76-80.

[19] Kokalis-Burelle N， Vavrina C S， Rosskopf E N， et al. Field evaluation of plant growth-promoting rhizobacteria amended transplant mixes and soil solarization for tomato and pepper production in Florida[J]. Plant and Soil， 2002， 238： 257-266.

[20] 張志紅， 李華興， 韋翔華， 等. 生物肥料對香蕉枯萎病及土壤微生物的影響[J]. 生態環境， 2008（6）： 2 421-2 425.

[21] 袁玉娟， 胡 江， 凌 寧， 等. 施用不同生物有機肥對連作黃瓜枯萎病防治效果及其機理初探[J]. 植物營養與肥料學報， 2014， 20（2）： 372-379.

[22] Shen Z Z， Zhong S T， Wang Y G， et al. Induced soil microbial suppression of banana fusarium wilt disease using compost and biofertilizers to improve yield and quality[J]. European Journal of Soil Biology， 2013， 57： 1-8.

[23] Shen Z Z， Wang D S， Ruan Y Z， et al. Deep 16S rRNA pyrosequencing reveals a bacterial community associated with banana Fusarium wilt disease suppression induced by bio-organic fertilizer application[J]. PloS one， 2014， 9： e98420.

[24] 鐘書堂， 沈宗專， 孫逸飛， 等. 生物有機肥對連作蕉園香蕉生產和土壤可培養微生物區系的影響[J]. 應用生態學報， 2015， 26（2）： 481-489.

[25] 劉小玉， 周登博， 譚 昕， 等. 香蕉枯萎病拮抗放線菌1-g-59的篩選與鑒定[J]. 生物技術通報， 2013（8）： 124-129.

[26] 梁 銀， 張谷月， 王 辰， 等. 一株拮抗放線菌的鑒定及其對黃瓜枯萎病的生防效應研究[J]. 土壤學報， 2013， 50（4）： 810-817.