HPLC法檢測明綠萌動過程中牡荊素和異牡荊素含量變化規律

萬婭瓊 程江華 吳翔

摘要 [目的]為更好地利用安徽明綠資源，開展了綠豆萌動試驗中牡荊素和異牡荊素的含量變化規律及其高效液相色譜法（HPLC）檢測方法研究。[方法]對安徽特產明綠進行萌動40 h，每4 h取樣1次，并用HPLC方法對樣品中牡荊素、異牡荊素含量進行檢測。[結果]萌動過程中牡荊素、異牡荊素基本上處于波動下降趨勢，但在萌動8 h時含量最高，分別為0.57、1.02 mg/g，在16 h時含量最低，并且異牡荊素含量是牡荊素含量的2倍左右。[結論]HPLC法檢測牡荊素、異牡荊素方法可靠，明綠萌動過程中，8 h時牡荊素、異牡荊素含量較高。

關鍵詞 明光綠豆；牡荊素；異牡荊素；萌動

中圖分類號 TS205 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0105-02

Abstract [Objective] In order to make better use of Anhui Mingguang mung bean resources，the vitexin and isovitexin content changes and HPLC detection methods were studied in the experiment of mung bean sprout.[Method] To sprout Mingguang mung bean for 40 h， and take sample 1 time per 4 h， vitexin and isovitexin content were detected by HPLC method. [Result] In the process of germination， the content of vitexin and isovitexin basically was in a downward trend， but in the germination of 8 h was the highest， respectively 0.57 and 1.02 mg/g， at the time of 16 h was the lowest， and the isovitexin basically was about 2 times the contents of vitexin. [Conclusion] HPLC method was used to detect Vitexin， isovitexin， the method is reliable， in the process of germinating mung bean， Vitexin and isovitexin were higher at 8 h.

Key words Mung bean；Vitexin；Isovitexin；Sprouting time

綠豆（Mung bean）為豆科豇豆屬綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek.]的成熟種子，別名青小豆（因其顏色青綠而得名）、菉豆、植豆等。綠豆原產于中國、印度、緬甸等國家，在我國已有2 000多年的栽培史，現在廣泛分布于東亞各國，非洲、歐洲、美國也有少量種植。明綠是安徽明光特產綠豆的簡稱，因其色澤碧綠、粒大皮薄、湯清易爛、味香爽口等特點和清熱解毒、抗過敏等作用，在國內外市場享有很高的聲譽。

綠豆營養成分全面，既是調節飲食的佳品，又是食品工業的重要原料，也是重要的藥材和化妝品添加劑。中醫認為，綠豆味甘、性涼、歸心胃經，具有清熱解毒、解暑除煩、利水消腫、清膽養胃、潤腸通便、明目、降血糖、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗過敏、保護肝臟和心血管、增強免疫力、排鉛等功效[1]。現代研究表明，這些功效與綠豆中含有的功能成分天然植物黃酮碳苷類化合物牡荊素和異牡荊素相關[2]。牡荊素和異牡荊素的生物活性已引起國內外研究人員的極大關注，近年來就牡荊素抗心肌梗死[3]、抗炎鎮痛[4]、降血壓、抗菌、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]等方面藥理作用進行了大量的研究。由于牡荊素和異牡荊素是同分異構體[7]，基本結構均為二羥基異黃酮，因此2個化合物在液相色譜條件下常合并在一起較難分離。該研究通過優化色譜條件，使牡荊素和異牡荊素兩峰得到很好地分離，且峰形良好，出峰時間短，提高了工作效率。

筆者以安徽明綠為原料，研究其萌發過程中牡荊素和異牡荊素的變化規律，旨在為開發明綠深加工產品提供實踐依據。同時為更好地滿足人們對天然活性成分牡荊素日益增長的需求，使其為人類的健康和保健做出更大貢獻，也為人們以綠豆及其萌芽作為食品、保健品及化妝品原料的高效應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。

原料：明光綠豆，徽王食品有限公司；綠豆不同時間萌動的樣品（包括實驗室和中試樣品）。

主要試劑：乙醇（分析純）、乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純），上海國藥集團化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水；牡荊素、異牡荊素標準品，上海優純生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設備。

Shimadzum LC-20A高效液相色譜儀，紫外檢測器；Alltech C18柱 （4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；電熱鼓風干燥箱，型號DHG-9023A；生化培養箱，型號SPX-70；超聲波清洗儀，型號XO25-12DTD；電子天平，型號ML104；旋轉蒸發儀，型號N-1100。

1.2 方法

1.2.1 綠豆萌動工藝[8]。

綠豆→篩選→清洗→消毒→純水清洗→浸泡→發芽→取樣→干燥→粉碎。

1.2.2 對照品溶液的制備。

精確稱量牡荊素、異牡荊素標準品20 mg，加甲醇制成0.1 mg/mL的母液，備用。

1.2.3 明綠萌動后樣品處理。

綠豆粉碎，過60目篩，稱取1.00 g粉末，按固液比1∶20（g∶mL）用75%乙醇溶液溶解，超聲波振蕩60 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液用旋轉蒸發儀蒸發，再用乙腈定容，過0.45 μm有機膜，濾液備用，此為待測樣品溶液。

1.2.4 牡荊素、異牡荊素的測定色譜條件。

色譜條件：色譜柱為Alltech C18，流動相為A為乙腈，B為0.2%乙酸，0～20 min，B由5%→25%；20～30 min，B由25%→90%；流速1 mL/min，檢測波長為365 nm，柱溫箱溫度35 ℃，樣品進樣量均為10 μL，以峰面積（A）和質量濃度（C，mg/L）繪制標準曲線；按信噪比S/N=3計算檢測限。

2 結果與分析

2.1 牡荊素和異牡荊素高效液相色譜（HPLC）檢測結果

牡荊素、異牡荊素對照品圖譜見圖1。由圖1可見，牡荊素出峰時間為19.685 min，異牡荊素出峰時間為20.392 min。

2.2 綠豆萌動工藝及過程中牡荊素、異牡荊素變化規律

挑選籽粒飽滿的明光綠豆，自來水清洗，體積分數75%的乙醇消毒5 min，純水清洗3遍。在生化培養箱中，采用培養皿+上蓋紗布模式萌動，及時補充水分，25 ℃黑暗試驗，發芽時間設定為從0 h開始，每4 h取樣1次，到40 h時一共取11個樣品，每個樣品取樣后及時在高低溫培養箱中，60～70 ℃下干燥含水量低于14%，冷卻后，4 ℃下密封避光保存，備用。

每個樣品按照“1.2.3”的方法處理，進樣，檢測結果見圖2。

由圖2可以看出，在綠豆萌動過程中牡荊素、異牡荊素和兩者總和基本處于波動下降趨勢，在8 h時處于萌動過程中的含量高峰期，分別為0.57、1.02、1.59 mg/g，在16 h時含量最低，分別為0.15、0.34、0.49 mg/g。在0～4和8～16 h時間內，牡荊素、異牡荊素下降最為明顯，在0～4 h內兩者含量分別減少了37.8%和37.5%。整個發芽過程中牡荊素和異牡荊素的含量變化趨勢基本一致，且異牡荊素含量基本保持在牡荊素含量2倍的水平。

3 結論與討論

牡荊素和異牡荊素是綠豆種子中含有的主要黃酮類物質，這2類物質在綠豆種子中含量最高，自萌芽開始，含量呈現波浪式下降趨勢，這說明萌芽綠豆中的牡荊素、異牡荊素可能是作為代謝原點和雙向代謝物質，并且在0～4、8～16 h代謝作用激烈，逐漸轉化為其他物質，在8、28 h又轉化為牡荊素和異牡荊素。因此，如果要利用萌動的明光綠豆中牡荊素和異牡荊素，最佳萌動時間為8 h。

試驗可知，萌動后的綠豆具有更廣泛的生物活性和豐富的次生代謝產物，該試驗只是考察了牡荊素、異牡荊素在明綠萌動過程中的變化趨勢，其他的蛋白質、氨基酸等未作分析，課題組下一步擬對萌芽綠豆中其他營養成分變化規律進行分析，了解綠豆萌動過程中代謝途徑及變化規律，為萌動綠豆在食品等相關領域的利用提供理論依據。

參考文獻

[1] 董銀卯.萌芽綠豆抗敏抗氧化活性物質分析及其作用機制研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2014：1-141.

[2] 顧成波，蔡曼，袁肖寒，等.牡荊苷的植物資源及藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（3）：382-389.

[3] 李晟，江勤，郭巖，等.牡荊素對實驗性心肌缺血的保護作用及機制研究[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：44-47.

[4] 程建忠，黃金華.牡荊素的鎮痛及抗炎免疫作用研究[J].中國醫藥指南，2016，14（31）：29-30.

[5] 李春正，蘇艷芳，靳先軍.牡荊屬植物化學成分及生物活性研究進展[J].中草藥，2005，36（6）：930-938.

[6] 方呈祥，孫海燕，姜浩，等.牡荊屬植物提取物抗腫瘤作用研究進展[J].現代生物醫學進展，2009，9（24）：4796-4797，4800.

[7] 馮廣衛，李翠兵，廖尚高，等.葒草素和異葒草素、牡荊素和異牡荊素2對碳苷化合物的快速檢測與鑒定[J].藥物分析雜志，2011，31（7）：1263-1268.

[8] 汪洪濤，陳成，余芳，等.3種大豆發芽過程中營養成分變化規律研究[J].食品與機械，2015，31（1）：30-32，163.