牛乳中產色葡萄球菌的分離與鑒定

費育超 倪宏波

摘要 [目的]確定送檢的患乳房炎病牛乳汁中是否有產色葡萄球菌感染。[方法]從患乳房炎病牛乳汁中分離致病菌，并對其進行鑒定，最后通過藥敏試驗篩選出對其敏感的藥物。[結果]分離菌16S rRNA基因片段為長度1 422 bp的核苷酸序列。經BLAST分析可知，其與產色葡萄球菌16S rRNA核苷酸序列相似性高達99%，確定其為產色葡萄球菌。藥敏試驗結果表明，產色葡萄球菌對環丙沙星和四環素高度敏感，而對多黏菌素-B、青霉素、克林霉素和諾氟沙星等不敏感。[結論]研究結果可為確定乳房炎的病原及治療方法提供新思路。

關鍵詞 奶牛乳房炎；16S rRNA；產色葡萄球菌；耐藥性分析

中圖分類號 S852.61 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0120-02

Abstract [Objective]To check whether there was Staphylococcus chromogenes infection in the milk of diseased cattle with mastitis.[Method]Pathogen were isolated and identified from the milk of diseased cattle with mastitis.And the sensitive drugs were screened out by drug susceptibility test.[Result] 16S rRNA gene fragment of the isolated bacteria was a nucleotide sequence with the length of 1 422 bp.BLAST analysis showed that its similarity with Staphylococcus chromogenes 16S rRNA nucleotide sequence was up to 99%，so it was confirmed as Staphylococcus chromogenes.Drug sensitivity test showed that it was highly sensitive to ciprofloxacin and tetracycline，and it was tolerant to polymyxinB，penicillin，clindamycin and norfloxacin and others.[Conclusion]The research results can provide new ideas for studying the pathogen and treatment methods of mastitis.

Key words Cow mastitis；16S rRNA；Staphylococcus chromogenes；Drug tolerance analysis

奶牛乳房炎是對乳品業危害最嚴重的疾病之一[1]。葡萄球菌是奶牛乳房炎發生的主要致病菌，分為凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase positive staphylococcus，CPS）和凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus，CNS）。產色葡萄球菌屬于CNS，是一種重要的條件性致病菌和免疫損傷時的感染菌，發生感染時往往不表現典型的臨床癥狀，但是當機體抵抗力降低或其進入非正常寄居部位時，可引起多種感染[2]。產色葡萄球菌常常定殖于乳頭且易在乳導管內增殖，會導致臨床型和隱性型乳房炎，頭胎牛比多胎牛更易感，感染后發展成臨床型乳房炎。近年來，產色葡萄球菌已成為臨床感染的重要病原菌，已經在牛乳[3]、雞和羊中分離到，并能產生毒素[4-5]，造成危害。隨著廣譜抗生素的長期不合理使用，葡萄球菌的耐藥性日益嚴重，特別是抗甲氧西林葡萄球菌的出現，多重耐藥性的特點使其成為臨床疾病治療上最棘手的問題之一。筆者從患乳房炎病牛乳汁中分離到1株多重耐藥的產色葡萄球菌，并對其進行了鑒定，最后通過藥敏試驗篩選出對其敏感的藥物。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 黑龍江省大慶市某牛場送檢的患乳房炎病牛乳汁。

1.2 培養基、試劑及試驗動物 血液瓊脂平板培養基、BHI液體培養基、具有氨芐抗性的LB培養基、PCR Master Mix 緩沖液、pMD18-T克隆載體和 DL 2000 Marker，均購自大連寶生物工程有限公司；GenStar 膠回收試劑盒、藥敏紙片，購自北京康潤誠業生物科技有限公司。雄性昆明系小鼠，體質量22 g，購自牡丹江醫學院實驗動物中心。

1.3 引物設計

根據GenBank數據庫中已發表的鏈球菌基因序列，設計了1對16S rRNA通用引物[6]，來擴增目的片段。正向引物為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 細菌分離培養

將奶樣離心處理后接種在血液瓊脂平板培養基上，置于37 ℃恒溫箱中培養24 h，染色并觀察菌落形態。對分離菌進行純培養后，接種于LB液體培養基中，37 ℃下振蕩培養20 h，觀察其生長情況。

1.5 動物試驗 挑取5只健康小鼠，分為試驗組與對照組，從試管中取0.5 mL菌液經由皮下注射給試驗小鼠，24 h后觀察小鼠的情況。

1.6 分離菌核酸的提取及鑒定

1.6.1 組織DNA的提取。

從致病菌液中取500 μL菌液置于1.5 mL離心管中，4 ℃，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入500 μL去離子水懸浮沉淀，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL去離子水，煮沸5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，獲得細菌的DNA，-20 ℃下保存備用。

1.6.2 PCR擴增。

以得到的DNA為模板，利用16S通用引物進行PCR擴增，取5 μL的擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 序列分析

按照GenStar 膠回收試劑盒說明書進行膠回收，然后取500 μL離心管，加入1 μL T載體、4 μL Buffer和5 μL的膠回收提取物，置于4 ℃恒溫箱中16 h進行連接并將其轉化到大腸桿菌的感受態中。挑取單菌落，接種于LB液體培養基中，置于搖床上，37 ℃下培養24 h， 將菌液分裝到2個1.5 mL的離心管中，送到測序公司進行16S rRNA雙向測序，并將測序結果在NCBI網站進行BLAST比對，確定致病菌。

1.8 藥敏試驗與耐藥性分析

致病菌接種于血液瓊脂培養基后，將藥敏紙片分別貼于平皿中，37 ℃下培養24 h，測量抑菌環直徑大小，根據檢測標準判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

菌株在血液瓊脂培養基上形成光滑、濕潤、乳白色不透明的小菌落，在LB液體培養基中生長較好，試管生成黏性沉淀物，鏡檢發現該致病菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列 。

2.2 PCR擴增結果 經過PCR擴增，獲得1條1 400 bp左右的條帶（圖1）。

2.3 序列分析結果

通過將菌體的測序結果與GenBank數據庫進行Blast對比發現，致病菌與產色葡萄球菌部分序列同源性達到99%，因此可確定該致病菌為產色葡萄球菌。

2.4 藥敏試驗結果 藥敏結果表明，分離菌對環丙沙星和四

環素高度敏感，對鏈霉素、紅霉素、阿米卡星中度敏感，對多黏菌素-B、青霉素、克林霉素和諾氟沙星等不敏感。

3 結論與討論

基于16S rRNA在鑒定細菌種屬的可靠性[7]與其序列高度保守的特點，筆者對致病菌株進行了16S rRNA鑒定，發現與產色葡萄球菌的同源性達到99%，由此確定該致病菌為產色葡萄球菌。

近年來，關于條件性致病菌的報道日益增多，這與飼料中添加抗生素與使用抗生素密切相關。該試驗中分離到的產色葡萄球菌是一株多重耐藥菌，對環丙沙星和四環素高度敏感，對青霉素和克林霉素等存在耐藥性。

產色葡萄球菌是引起奶牛亞臨床乳房炎的高流行致病菌，已明確其對體細胞數量產生影響，但有關該菌及抗菌藥物敏感性的研究報道不多。盧天舒等[8]研究發現凝固酶陰性葡萄球菌的主要致病機理與溶血素和細菌胞壁外的黏液物質有關，細菌胞壁外的黏液物質在細菌黏附、抗吞噬和抵抗宿主免疫防御機能方面起重要作用。然而，目前產色葡萄球菌的致病機理尚不明確。筆者從患乳房炎病牛乳汁中分離致病菌，經鑒定確定為產色葡萄球菌，可為確定乳房炎的病原及治療方法提供新思路。

參考文獻

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