不同方法提取苦蕎蛋白的體外抗氧化活性研究

何曉蘭 雷霆雯 許慶忠

摘要 [目的]研究不同方法提取苦蕎蛋白的體外抗氧化活性。[方法]以貴州威寧種植的苦蕎為材料，通過(guò)蛋白質(zhì)含量測(cè)定、清除羥基自由基能力測(cè)定對(duì)堿溶酸沉法提取苦蕎粗蛋白和Osborne法分級(jí)提取苦蕎清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白進(jìn)行了比較分析。[結(jié)果]通過(guò)堿溶酸沉法提取能獲得大量的可溶性蛋白，Osborne法提取的蛋白雖然含量較低但獲得的種類較多；各種蛋白均具有清除羥基自由基的能力，其清除羥基自由基能力從大到小依次為清蛋白、堿溶酸沉法提取的粗蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。[結(jié)論]堿溶酸沉法和Osborne法提取的苦蕎蛋白均具有體外抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 苦蕎蛋白；堿溶酸沉法；Osborne法；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）25-0134-02

Abstract [Objective] The research aimed to study the antioxidant activity in vitro of tartary buckwheat proteins by different methods. [Method]Tartary buckwheat proteins was prepared by alkalisolution and acidisolation， and albumin， globulin， prolamin and glutelin from tartary buckwheat were obtained by different solubility extraction. The coomassie brilliant blue protein quantitative was used in determination of protein concent and chemical colorimetric method was used to determinate the ability to remove hydroxyl radicals（·OH） of each protein fraction.[Result]The results showed that proteins obtained by alkalisolution and acidisolation methos were the predominant fraction. Proteins extracted by different methods had the ability to remove hydroxyl radicals， and the order of radical scavenging activity was albumin， proteins obtained by alkalisolution and acidisolation methods， glutelin， globulin and prolamin.[Conclusion]Both the alkalisoluble acid precipitation method and the Osborne method have the antioxidant capacity of tartary buckwheat protein.

Key words Tartary buckwheat proteins；Alkalisolution and acidisolation method；Osborne method；Antioxidant activity

苦蕎，又名韃靼蕎麥，屬于蓼科蕎麥屬。我國(guó)苦蕎種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]，主要生長(zhǎng)在我國(guó)的西南山區(qū)。《神龍書(shū)》中將苦蕎認(rèn)為是“五谷雜糧之王也”，說(shuō)明苦蕎是一種舉足輕重的功能性食品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值均較高。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，苦蕎蛋白具有降低血漿膽固醇、改善便秘、抑制脂肪蓄積和預(yù)防腫瘤的作用[2]，這可能與苦蕎蛋白的低消化率有關(guān)[3]。苦蕎蛋白質(zhì)的氨基酸組成比較均衡，具有較高的生物價(jià)值[4]。苦蕎蛋白富含人體限制性氨基酸（賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸），精氨酸的含量也較高，與小麥相比，苦蕎蛋白中谷氨酸和脯氨酸的含量低[5]。有研究報(bào)道苦蕎蛋白的低消化率、賴氨酸和精氨酸的比例以及蛋氨酸和甘氨酸的比例是苦蕎蛋白具有降低血漿膽固醇作用的關(guān)鍵因素[6]。同時(shí)，苦蕎蛋白還富含硫胺素結(jié)合蛋白，可以作為維生素B1的補(bǔ)充劑[7]。

目前，分離植物種子蛋白的方法主要有堿溶酸沉法、乙醇提取法、膜分離法、酶解酸沉法、離子交換法和Osborne法等[8]。其中，堿溶酸沉法是利用弱堿性水溶液浸泡脫脂苦蕎粉，將其中的可溶性蛋白質(zhì)萃取出來(lái)，然后用一定量的鹽酸水溶液加入已溶解出的蛋白質(zhì)液中，調(diào)節(jié)其pH到苦蕎蛋白的等電點(diǎn)，使大部分蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)得到苦蕎分離蛋白產(chǎn)品。該法操作方便、無(wú)需加熱、節(jié)約能源、成本低、沉淀快、可減少生物堿含量，并可破壞多種不利因子，如某些酶類、植物雌激素和皂素等[9]。Osborne分離法的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度不同的性質(zhì)，利用最簡(jiǎn)單的溶液/沉淀分離手段將可溶性蛋白與不溶性蛋白進(jìn)行分離；盡管該方法發(fā)明已經(jīng)有100多年歷史，尚有改進(jìn)的余地，而且蛋白質(zhì)的總回收率也不高，但是可以將清蛋白（Albumin）、球蛋白（Globulin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）4種組分逐一分離開(kāi)來(lái)。筆者分別采用了堿溶酸沉法和Osborne法提取苦蕎蛋白，并比較各分離蛋白的體外清除羥基自由基能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。苦蕎粉，購(gòu)自貴州威寧苦蕎專賣店。

1.1.2 主要試劑。NaOH、NaCl，成都市聯(lián)合化工試劑研究所；羥基自由基測(cè)定試劑盒、抗超氧陰離子測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器。DF-II數(shù)顯集熱式磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；三用電熱恒溫水箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-3C實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；超速冷凍離心機(jī)3K30，德國(guó)SIGMA；AP-01P真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1

堿溶酸沉法提取苦蕎粗蛋白。苦蕎粉用石油醚浸泡24 h脫脂后抽干，再用三氯甲烷浸泡8 h脫去生物堿，抽干后將已脫脂脫生物堿的苦蕎粉按1∶10的比例加入ddH2O，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0后置于磁力攪拌器內(nèi)攪拌2 h，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，離心后取上清用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至4.5接近苦蕎粗蛋白的等電點(diǎn)，以利于苦蕎蛋白沉淀，蛋白沉淀用ddH2O沖洗2次后用0.1 mol/L的NaOH調(diào)至中性，置于-20 ℃冰箱凍存24 h，再將凍結(jié)的蛋白置于冷凍抽干機(jī)抽去水分，由此制得苦蕎粗蛋白粉末。該粉末置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2

Osborne法分級(jí)提取苦蕎清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。苦蕎粉用石油醚浸泡24 h脫脂后抽干，再用三氯甲烷浸泡8 h脫去生物堿，抽干后將已脫脂脫生物堿的苦蕎粉按1∶10的比例加入ddH2O，置于磁力攪拌器內(nèi)室溫?cái)嚢? h，4 ℃ 4 000 r/min離心30 min，將上清與沉淀分離，上清中含有清蛋白，將上清置于-20 ℃冰箱凍存，沉淀加入10倍體積2%的NaCl，置于磁力攪拌器內(nèi)室溫?cái)嚢? h，4 ℃ 4 000 r/min 離心30 min，再次將上清與沉淀分離，上清中含有球蛋白，上清置于-20 ℃冰箱凍存，沉淀加入10倍體積70%的乙醇，重復(fù)上述步驟得到醇溶蛋白；繼續(xù)向所得沉淀物中加入10倍體積0.005 mol/L的NaOH，再次重復(fù)上述提取步驟，得到谷蛋白。最后棄掉沉淀，將所分離提取的4種蛋白置于透析袋中，用去離子水于4 ℃下透析48 h后，凍置于冷凍抽干機(jī)抽去水分，由此制得苦蕎清蛋白、苦蕎球蛋白、苦蕎醇溶蛋白、苦蕎谷蛋白粉末。蛋白粉末置于-20 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。

1.2.3

苦蕎蛋白定量。

1.2.3.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）分別加入到試管中，加入PBS補(bǔ)足至150 μL，向各試管中加入2.85 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置10 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蛋白含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.2.3.2

蛋白含量的測(cè)定。將稱量好的苦蕎蛋白溶于一定體積的雙蒸水，充分混勻后制得樣品液。取50 μL樣品液于干凈試管中，然后用PBS補(bǔ)足到150 μL，再加入考馬斯亮藍(lán)染液2.85 mL，混勻，室溫靜置10 min，于波長(zhǎng)595 nm 處比色，讀取吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出樣品液的蛋白含量。

1.2.4

苦蕎蛋白各組分凍干粉清除羥基自由基活性測(cè)定。按照羥基自由基測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，即先選取合適的取樣濃度，以抑制率在20%～50%為最佳取樣濃度。設(shè)置好取樣濃度后根據(jù)下列公式計(jì)算出各蛋白組分抑制羥基自由基能力（U/mg）。

抑制羥基自由基能力=對(duì)照吸光度-測(cè)定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)吸光度-空白管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管濃度蛋白毫克數(shù)×取樣量

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎粗蛋白、清蛋白 、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白含量測(cè)定

各組蛋白采用考馬斯亮藍(lán)顯色法進(jìn)行定量，根據(jù)線性回歸方程Y=0.012 6X+0.019 0（R2 =0.996 3）計(jì)算出各組蛋白濃度，并計(jì)算各組蛋白與脫脂苦蕎粉的比例。結(jié)果表明，由堿溶酸沉法提取的苦蕎粗蛋白在脫脂苦蕎粉中含量最高，為82.05 mg/g；Osborne法提取的各分離蛋白中，清蛋白含量最高，為13.24 mg/g，醇溶蛋白含量最低，為2.96 mg/g。比較堿溶酸沉法和Osborne法提取的苦蕎蛋白量發(fā)現(xiàn)，堿溶酸沉法可得到較多的苦蕎蛋白，而Osborne法提取的苦蕎蛋白量較低，總量為31.04 mg/g，但可以獲得比較多的蛋白種類，便于對(duì)各種蛋白的功能特性進(jìn)行分析。

2.2 苦蕎蛋白凍干粉各組分清除羥基自由基活性

采用比色法分別測(cè)定堿溶酸沉法提取的苦蕎粗蛋白、Osborne法分級(jí)提取的苦蕎清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白清除羥基自由基的能力。由于VC是一種重要的自由基清除劑，常用來(lái)衡量其他物質(zhì)抗氧化活性的大小，故選用VC作為參照。結(jié)果表明（圖1），各種方法提取的苦蕎蛋白均具有抑制羥基自由基活性作用，且都隨濃度的升高，抑制率升高，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，量效關(guān)系明顯，符合二次曲線方程。經(jīng)計(jì)算，各分離蛋白抑制羥基自由基活性的IC50（當(dāng)抑制率為50%的樣品濃度）為：堿溶酸沉法提取的苦蕎粗蛋白的抑制率為0.433 9 g/L、清蛋白為0.058 5 g/L、球蛋白為0.753 1 g/L、醇溶蛋白為4.308 7 g/L、谷蛋白為0.482 5 g/L，VC的抑制率為0.114 7 g/L。

選取各分離蛋白清除羥基自由基抑制率在45%～55%的樣品濃度進(jìn)行抑制羥基自由基能力計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清除羥基自由基能力從大到小依次為清蛋白（352.192）、VC（311.952）、堿溶酸沉法提取的苦蕎粗蛋白（52.639）、谷蛋白（47.586）、球蛋白（33.964）、醇溶蛋白（4.932）。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)堿溶酸沉法和Osborne法提取出苦蕎蛋白，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)由堿溶酸沉法提取出的苦蕎粗蛋白凍干粉蛋白含量最高，脫脂苦蕎粉中含苦蕎粗蛋白82.05 mg/g，Osborne法提取出的各蛋白凍干粉雖含量相對(duì)較低但蛋白種類多。幾種蛋白組分均具有抑制羥基自由基的作用，清除羥基自由基能力從大到小依次為清蛋白、粗蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。其中，清蛋白抑制羥基自由基的作用強(qiáng)于傳統(tǒng)的自由基清除劑VC。

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