內生菌與雷公藤細胞懸浮共培養的生理生化特性

宋歡 宋萍 封磊 洪偉 吳承禎 王一惠 申露文

摘 要 將2株雷公藤內生真菌Fusarium oxysporum NS33與Penicillium steckii NS6、2株內生細菌Enterobacter cloacae sub sp LG3與Serratia marcescens LY1及其組合分別與雷公藤細胞懸浮共培養，對不同培養體系內雷公藤細胞的生長及其生理生化特征進行研究。結果顯示，在共培養前期，與對照相比，接種單一內生菌株提高了細胞的干重，其中菌株NS6的促生效果最明顯；而在共培養后期，無論是單一內生菌還是混合內生菌均對細胞生長具有抑制作用。內生真菌和菌株組合處理的培養液pH值有明顯的升高，而內生細菌LY1則明顯降低了培養液的pH值，其具有產酸性。另外，當雷公藤細胞同混合菌株共培養時，培養基中總糖消耗量是最大的，而接種單獨菌株時則對細胞可溶性蛋白含量具有一定的提高作用。接種內生菌會影響雷公藤細胞的POD、CAT及SOD活性，與對照相比，接種單獨菌株會更加提升POD與CAT的活性，而細胞MDA含量則明顯下降。

關鍵詞 內生菌；懸浮細胞；雷公藤；生理生化

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A

Abstract In this study， two endophytic fungi， Fusarium oxysporum NS33 and Penicillium steckii NS6， and two endophytic bacteria， Enterobacter cloacae sub sp LG3 and Serratia marcescens LY1， isolated from Tripterygium wilfordii， and their combinations were co-cultured with T. wilfordii cells， respectively. The growth and physio-biochemical properties of T. wilfordii suspension cells were studied in the various co-culture systems. The results showed that in the early stage of co-culture all the single strain promoted the T. wilfordii cell growth and the NS6 strain exhibited the most significant effect， however， during the late period all the endophytic strains and their combinations acted a negative role on the plant cell growth. When T. wilfordii cells were co-cultured with the two endophytic fungi and the strain combinations， the pH values of supernatants increased obviously， but for the T. wilfordii cells and LY1 strain co-culture system， the pH values decreased. In addition， the sugar consumption of supernatants was the highest when T. wilfordii cells were co-cultured with the mixed strains， and the soluble protein content was enhanced as the strains were inoculated singly. The activities of POD， CAT and SOD of T. wilfordii cells were influenced by the endophytes. Compared with the control， the single strain inoculation made T. wilfordii cells exhibited the higher activities of POD and CAT and the lower MDA content.

Key words Endophyte； suspension cell； Tripterygium wilfordii； physiology and biochemistry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.017

雷公藤（Tripterygium wilfordii）屬衛矛科雷公藤屬，是一種珍貴的藥用植物[1]，體內含有多種具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗艾滋病毒以及免疫抑制等功能的活性物質[2-3]。由于具有廣泛的藥理作用，雷公藤的市場需求量巨大，然而近年來野生雷公藤資源濫砍亂挖現象嚴重，加之人工栽培生長周期緩慢，致使該藥用植物的蘊藏量逐年下降，遠遠無法滿足國內外市場的需求。

由于植物次生代謝產物結構的復雜性，化學合成難度較大。細胞懸浮培養，被認為是一種解決藥用植物資源短缺的有效途徑。但在培養過程中，由于植物細胞自身生長速率慢、穩定性差，以及易受操作條件影響等原因，該類技術的廣泛應用受到限制。因此，如何促進藥用植物懸浮細胞的快速生長，一直是國內外相關領域的研究熱點。近年來的研究發現，藥用植物內生菌對宿主植物具有顯著的促生長作用，從而引起了研究者的廣泛關注。Li等[4]將紅豆杉細胞與內生真菌Fusarium mairei進行共培養，發現該株內生真菌不但能促進宿主細胞的生長，還可以有效提升共培養系統內活性物質的生成；張寶俊等[5]將梨樹內生細菌LP-5與梨樹進行共生長研究，結果表明該菌株可明顯促進梨樹幼苗的生長；張瑞芬等[6]從盾葉薯蕷中分離的內生真菌可以提高盾葉薯蕷無菌苗和培養細胞的薯蕷皂苷的含量和產量；陳世蘋等[7]在研究內生真菌感染對黑麥草葉片內相關酶活性的影響時發現，感染葉片內SOD和POD活性明顯高于正常植株；Carvalho等[8]的研究表明，Rhizoctoniasolani誘導子與純天仙子細胞懸浮共培養能引起細胞生長及營養物質含量的巨大變化。綜上所述，國內外學者已分別就藥用植物的內生細菌、內生真菌對宿主的促生作用進行了較為深入的研究。然而作為生長在植物體內的兩類主要微生物，內生真菌與內生細菌必然存在著一定的聯系，而這種聯系又會對宿主植物的生長有何影響，目前與此相關的研究尚未見報道。

鑒于此，本研究將分離自雷公藤植株內部、具有益生作用的2株內生真菌、2株內生細菌以及兩者的組合接種于雷公藤細胞懸浮培養體系中，分析雷公藤懸浮細胞對內生菌的生理生化響應，考察內生真菌與內生細菌之間、單一菌株與混合菌株之間對雷公藤細胞的影響是否具有明顯的差異，從而為雷公藤細胞懸浮培養系統生物誘導子的應用奠定基礎，并為植物生長調節菌劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤愈傷組織為實驗室保藏，由葉片誘導而來，種源地為福建泰寧。經連續繼代培養3代以上后，挑選質地疏松，生長快，容易分散的淡黃色愈傷組織作為懸浮培養的材料。

供試菌株分別為2株內生真菌Fusarium oxysporum NS33，Penicillium steckii NS6和2株內生細菌Enterobacter cloacae subsp LG3，Serratia marcescens LY1，均分離自健康雷公藤植株，由實驗室保藏。內生真菌和內生細菌進行兩兩組合共形成4組菌株組合，即NS33-LG3、NS33-LY1、NS6-LG3、NS6-LY1。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培養 內生真菌在PDA固體培養基上活化5 d后，轉接到新的PDA固體培養基上繼續培養7 d待用；內生細菌則在LB固體培養基上活化2 d后，轉接于LB液體培養基上繼續培養至指數階段，4 ℃，8 000 ×g離心10 min獲取菌體。

1.2.2 雷公藤細胞懸浮培養 將0.4 g生長狀況良好的連續繼代培養3代以上的雷公藤愈傷組織轉接到裝有40 mL預先滅菌的培養液的三角瓶中，培養基成分為MS+0.5 mL 2，4-D+0.5 mL IBA+0.1 mL KT[9]，將三角瓶置于120 r/min、25 ℃的搖床上懸浮暗培養，7 d后在超凈臺下分別進行菌株添加處理，其中4個處理為內生真菌或內生細菌菌株的單獨接種，4個處理為內生真菌和內生細菌的混合接種。真菌采用打孔器挑起d=5 mm的菌塊直接投入每瓶培養基中。將細菌用無菌水清洗3次，稀釋成OD值為0.5的菌懸液，然后將1 mL菌懸液加入到雷公藤愈傷培養液中。以添加無菌水的處理作為空白對照（CK），分別于第1、2、4、6天取樣。

1.2.3 細胞干重的測定 將新鮮細胞在60 ℃恒溫烘箱中，烘干至恒重，用天平稱其質量。

1.2.4 培養液pH值的測定 采用PHS-2型精密酸度計測定培養液pH值。

1.2.5 總糖含量的測定 采用蒽酮比色法測定培養液中的總糖含量。

1.2.6 生理生化指標的測定 將雷公藤愈傷組織用無菌水沖洗數次后，加入0.1 mol/L、pH7.8的磷酸鹽緩沖液5 mL，在預冷的研缽中進行冰浴勻漿，在4 ℃下、12 000 ×g離心10 min，取上清液進行生理生化指標的測定。超氧化物歧化酶（SOD）采用核黃素-氯化硝基氮藍四唑（NBT）光化還原法測定；過氧化物酶（POD）采用愈創木酚比色法測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）加熱顯色法測定；過氧化氫酶（CAT）采用紫外吸收法法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定。詳細方法見參照文獻[10-11]。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS18.0統計分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 對細胞生長的影響

不同的內生菌加入雷公藤細胞懸浮培養體系后，對細胞的生長都產生了一定的影響。由圖1可見，在共培養前期，接種菌株NS33、NS6、LG3能夠促進細胞的生長，細胞干重高于對照，尤其是菌株NS6，具有明顯的促生效果，在第4天時細胞干重約是對照的2倍。隨著共培養時間的延長，無論接種單一菌株還是混合菌株，對細胞生長均產生抑制作用。

2.2 對培養液pH值的影響

向雷公藤懸浮細胞培養體系中加入內生真菌、內生細菌及兩者的組合后，其pH值的變化情況如圖2所示。與對照相比，隨著共培養時間的增加，添加內生真菌單一菌株NS33和NS6提高了培養液的pH值，在共培養第4天時明顯高于對照，第6天時最大。添加內生細菌菌株LG3和LY1處理的培養液pH值則相對比較穩定，但與對照相比，LG3處理的培養液pH值在共培養1 d時有明顯提高，其后則與對照相近，至6 d時又低于對照；而菌株LY1處理2 d后的培養液pH值均明顯低于對照。內生真菌和內生細菌的組合添加處理亦明顯提高了培養液的pH值，其變化趨勢與單一內生真菌的處理相似，處理4 d和6 d時pH值明顯高于對照。

2.3 對培養液總糖消耗的影響

向雷公藤懸浮細胞培養體系中加入內生真菌、內生細菌及兩者的組合后，培養液中總糖含量的變化如圖3所示。可見，隨著共培養時間的增加，對照組的總糖消耗最少，下降最緩慢；內生真菌單菌株的處理相對于內生細菌單菌株的處理，總糖消耗量更多，總糖含量下降更快；4組內生真菌與內生細菌組合處理的總糖含量變化趨勢比較一致，總糖含量的下降速度是所有處理中最快的。

2.4 對細胞可溶性蛋白含量的影響

向雷公藤細胞懸浮培養體系中加入內生真菌、內生細菌及兩者的組合后，細胞可溶性蛋白含量的變化情況如圖4所示。隨著共培養時間的增加，接種單一菌株的細胞可溶性蛋白含量呈現逐漸增加的趨勢，其中接種內生真菌菌株NS6的細胞可溶性蛋白含量的增加速度最快，至第4天時明顯高于其他處理，在第6天時最大。而對照和接種了混合菌株（除了NS33-LG3）的細胞的可溶性蛋白含量在共培養6 d時均出現下降，此時，接種單一菌株NS6、LG3、LY1及混合菌株NS33-LG3處理的細胞可溶性蛋白含量明顯高于對照。

2.5 對細胞POD活性的影響

POD是植物細胞內重要的活性氧清除劑，是植物細胞壁形成和木質素合成的關鍵酶，在植物體內活性與植物的抗性有關。由圖5可見，隨著共培養時間的增加，對照組的懸浮細胞POD活性在共培養初期變化不大，共培養6 d時則有明顯的增加，出現峰值；接種菌株NS33的懸浮細胞POD活性隨著共培養時間的延長呈現不斷增加的趨勢；接種菌株NS6的懸浮細胞POD活性則在第1天即達到一峰值，之后呈下降趨勢，至第6天時再次上升出現第2個峰值；接種內生細菌菌株LG3、LY1的懸浮細胞POD活性則表現為先升后降再升的變化，至第6天時升高至一峰值。由此可見，對照和單一菌株處理的懸浮細胞POD活性均在培養后期，即第6天出現峰值，此時單菌處理（除NS33處理外）的細胞POD活性高于對照。不同于對照和接種單一菌株的處理，接種混合菌株NS33-LG3、NS33-LY1和NS6-LG3的懸浮細胞POD活性隨著共培養時間的增加呈現先升后降的變化，均在第2天達到極大值，且明顯高于對照。而接種混合菌株NS6-LY1的懸浮細胞POD活性則在第1天和第4天具有較大值。

2.6 對細胞CAT活性的影響

由圖6可見，隨著共培養時間的增加，對照組懸浮細胞的CAT活性呈小幅度的先升后降，但總體變化不大。與菌株LY1、NS33-LY1、NS6-LG3共培養的懸浮細胞CAT活性亦呈先升后降的變化，第2天時出現峰值，此時CAT活性均高于對照。與菌株NS33、NS6、LG3和NS33-LG3共培養的懸浮細胞CAT活性則呈上升趨勢，共培養6 d時CAT活性最大，明顯高于對照，其中與菌株NS6共培養的細胞CAT活性變化率最大，第4天和第6天時的活性明顯高于對照和其他處理。與混合菌株NS6-LY1的懸浮細胞CAT活性則隨著共培養時間的延長而先較快速增加而后下降，在第2天時明顯高于對照，第4天時活性最大。

2.7 對細胞SOD活性的影響

SOD是植物體內最重要的保護酶之一，該酶與植物的衰老及抗逆性密切相關，其與POD、CAT酶進行協同作用，能及時清除自由基和活性氧，提高植物組織的抗氧化能力。從圖7可以看出，對照組的懸浮細胞SOD活性隨著共培養時間的增加呈現下降趨勢，第1天時SOD活性最大。隨著共培養時間的增加，與單一菌株NS6、LG3、LY1和混合菌株NS33-LG3共培養的懸浮細胞SOD活性均呈下降趨勢，SOD活性在第1天時最大，但與對照相比，沒有明顯的增加或降低，至第6天時則均低于對照。與菌株NS33和NS33-LY1、NS6-LG3、NS6-LY1共培養的懸浮細胞則在第4天或第6天時SOD活性更高，并高于對照。

2.8 對細胞MDA含量的影響

植物在逆境或衰老狀態下，會發生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的產物之一，其可以間接反映出在逆境狀態下植物細胞的受損程度。從圖8可以看出，與內生菌共培養初期，懸浮細胞的MDA的含量有所增加，在第1天時都高于對照組，其中，與菌株NS33共培養的細胞MDA含量最大，其次是與混合菌株NS33-LG3共培養的細胞MDA含量。隨著共培養時間的增加，對照的細胞MDA含量先上升后保持相對的穩定，而與菌株NS33、NS6、LY1共培養的懸浮細胞MDA含量則具有明顯的下降，與混合菌株NS33-LY1、NS6-LG3、NS6-LY1共培養的細胞MDA含量則有小幅上升或保持穩定。但共培養至第6天時，大部分共培養的懸浮細胞MDA含量有較大的降低，明顯低于對照。

3 討論

植物內生菌與宿主長期協同進化中，彼此形成了一種互利共生的關系，其促進植物生長發育的功能已得到廣泛證實[12]。本研究中，將雷公藤內生真菌、內生細菌及兩者的組合接種到細胞懸浮培養體系中，在共培養初期，單一內生菌株促進了細胞生長，其中菌株NS6的促生作用最明顯。研究顯示，雷公藤內生菌具有一定的固氮、溶磷、分泌IAA、產鐵載體等能力[13]，菌株的這些植物促生特性可能是其促進懸浮細胞生長的機制之一。但隨著菌株與細胞懸浮共培養時間的延長，內生菌株反而抑制了細胞的生長，這可能是由于營養消耗加大，彼此間的競爭增強所致，也可能是菌株代謝物中含有抑制細胞生長的物質，或是共培養過程中菌株誘導細胞產生了一些自毒物質[14]。內生真菌和內生細菌的組合對雷公藤懸浮細胞并未顯示出促生長的作用，反映出兩者在促進植物生長方面可能不具有協同效應。

向雷公藤細胞懸浮培養體系添加內生真菌及內生真菌與內生細菌的組合后，培養液的pH值有明顯的升高。石岳香等[15]研究內生真菌導子對長春花懸浮細胞及生物堿合成的影響時，其培養液的pH值也有所提高。而雷公藤內生細菌尤其是菌株LY1則降低了培養液的pH值，說明菌株LY1具有產酸性，而該菌株較高的溶磷能力[13]可能也與其產酸性有較大關系。在植物細胞培養中，高量的糖常會促進細胞的生長[16]。在雷公藤細胞與內生菌懸浮共培養體系中，總糖消耗量從大到小依次為內生真菌菌株與內生細菌菌株組合處理、單一內生真菌處理、單一內生細菌處理、對照組。可見，內生菌與植物細胞共培養時，需要消耗更多的糖分來滿足兩者的生長需要，而相對于單菌，混合菌株需要消耗的糖分亦更多。可溶性蛋白質可以反映植物細胞總體代謝水平的高低。隨著培養時間的增加，雷公藤懸浮細胞的可溶性蛋白呈現增加的趨勢，與內生真菌菌株NS6共培養的細胞可溶性蛋白增加量最多，反映出菌株NS6對細胞可溶性蛋白的合成可能具有一定的誘導作用。除此之外，接種單一內生細菌菌株對懸浮細胞可溶性蛋白含量亦具有一定的提高作用。而接種混合菌株在共培養后期對懸浮細胞的可溶性蛋白的合成顯示出了抑制作用。

植物在遭受各種逆境脅迫時，體內POD、CAT等抗氧化酶協同作用能夠能防御和減緩活性氧及其他過氧化自由基過量累積對細胞系統的傷害，從而增強植物的抵抗能力[17-19]。雷公藤細胞在與單一內生菌懸浮共培養過程中，細胞的POD、CAT活性多在共培養后期出現峰值，并且各峰值高于對照，表明在培養后期系統出現氧化脅迫，抗氧化酶活性受到促進，而單一內生菌在一定程度上又提高了抗氧化酶活性。因而，此階段與單一菌株共培養的細胞MDA含量出現明顯的下降，反映出抗氧化酶活性的提高減輕了細胞的過氧化損傷。內生真菌與內生細菌組合懸浮共培養的細胞，POD、CAT活性多在共培養初期出現明顯升高，可能是菌株的添加誘導了細胞的抗氧化酶活性的提高；而在培養后期，POD活性有明顯的降低，MDA含量則較高，顯示細胞膜脂過氧化較嚴重，細胞生長受到抑制。雷公藤細胞的POD、CAT活性升高時，SOD活性反而下降了，這與顏曉藝等[17]、周珩等[20]的實驗結果相一致。

參考文獻

[1] 李家實. 中藥鑒定學[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 2000： 132.

[2] 洪 偉， 李 鍵， 吳承禎， 等. 雷公藤栽培及利用研究綜述[J]. 福建林學院學報， 2007， 27（1）： 92-96.

[3] 劉明星， 董 靜， 楊亞江， 等. 雷公藤甲素的研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2005， 30（3）： 170-174.

[4] Li Y C， Tao W Y， Cheng L. Paclitaxel production using co-culture of Taxus suspension cells and paclitaxel-producing endophytic fungi in a co-bioreactor[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2009， 83（2）： 233-239.

[5] 張寶俊， 張家榕， 韓巨才， 等. 梨樹內生細菌LP-5的鑒定及其促生作用研究[J]. 核農學報， 2010， 24（2）： 249-253.

[6] 張瑞芬， 李培琴， 趙江林， 等. 盾葉薯蕷內生真菌及其對宿主培養物生長和皂苷元生產的影響[J]. 天然產物研究與開發， 2010， 22（1）： 11-15.

[7] 陳世蘋， 高玉葆， 梁 宇， 等. 水分脅迫下內生真菌感染對黑麥草葉內保護酶系統活力的影響[J]. 應用與環境生物學報， 2001， 7（4）： 348-354.

[8] Carvalho E B， Curtis W R. Effect of elicitation on growth， respiration， and nutrient uptake of root and cell suspension cultures of Hyoscyamusmuticus[J]. Biotechnology Progress， 2002， 18（2）： 282-289.

[9] 李建娟， 洪 偉， 吳承禎， 等. 雷公藤優良無性系組織培養技術的研究[J]. 福建林學院學報， 2009， 29（4）： 315-319.

[10] 高俊鳳. 植物生理學實驗指導[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006.

[11] Sofo A， Dichio B， Xiloyannis C， et al. Effects of different irradiance levels on some antioxidant enzymes and on malondialdehyde content during rewatering in olive tree[J]. Plant Sci， 2004， 166（2）： 293-302.

[12] 李 群， 汪 超， 唐 明， 等. 灰氈毛忍冬 ‘渝蕾1號 內生菌對其懸浮細胞生物量及綠原酸含量的影響[J]. 植物生理學報， 2015， 51（11）： 1 997-2 005.

[13] 許進嬌， 宋 萍， 封 磊， 等. 雷公藤內生細菌的促生作用及其對雷公藤甲素生成的影響[J]. 應用生態學報， 2014， 25（6）： 1 681-1 687.

[14] Lan W Z， Yu L J， Li M Y， et al. Cell death unlikely conributes to taxolproduction infungalelicitor-induced cell suspension cultures of Taxuschinensis[J]. Biotechnol Lett， 2003， 25 （1）： 47-49.

[15] 石岳香， 周 敏， 楊 華， 等. 內生真菌和誘導子對長春花懸浮細胞及生物堿合成的影響[J]. 現代生物醫學進展， 2009， 9（5）： 886-889.

[16]韓素菊， 黎云祥. 巫山淫羊藿懸浮培養細胞的生長特性研究[J]. 中草藥， 2011， 42（8）： 1 609-1 613.

[17] 顏曉藝， 趙 丹， 吳承禎， 等. 4種誘導劑對雷公藤幼苗葉片生長及內酯醇含量的影響[J]. 應用與環境生物學報， 2015， 21（4）： 607-615.

[18] Vranová E， Inzé D， Van B F. Signal transduction during oxidative stress[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53： 1 227-1 236.

[19] Zhang J X， Kirkham M B. Drought-stress-induced changes in activities of superoxide dismutase， catalase， and peroxidase in wheat species[J]. Plant Cell Physio1， 1994， 35 （5）： 785-791.

[20] 周 珩， 郭世榮， 邵慧娟， 等. NaCl和Ca（NO4）2脅迫對黃瓜幼苗生長和生理特性的影響[J]. 生態學報， 2014， 34（7）： 1 880-1 890.